第二节　病原生物分离培养与鉴定

答：大多数动植物的研究、利用都能以个体为单位进行，而微生物由于个体微小，绝大多数情况下都是利用群体来研究其属性，微生物的物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存。微生物学中，在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物。只有一种微生物的培养物称为纯培养物。由于在通常情况下纯培养物能较好地被研究、利用和重复结果，因此把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进行微生物学研究的基础。在临床微生物学检验中，细菌感染性患者标本只有经过细菌的分离培养、鉴定和药物敏感性试验，才可对感染性疾病进行病原诊断并指导临床用药，因此，细菌分离培养与鉴定（isolation，culture and identification of bacteria）对感染性疾病的诊断、预防和治疗具有重要的作用，也被称作细菌导致的感染性疾病诊断的“金标准”。

答：细菌体外人工培养是一种用人工方法使细菌在体外的培养基上生长繁殖的技术，应用此技术可以使细菌生长并表现出一定的生长特征。人工制备营养充足的培养基并提供适宜的温度、气体、pH等培养条件，即能使某些细菌在体外环境迅速生长繁殖。细菌培养对临床上病原菌的分离鉴定、制备抗生素、疫苗等生物制品都是必不可少的。细菌的人工培养程序为：标本（估计菌量少的标本，先增菌培养）→根据培养目的，接种于适当的培养基→适宜的培养环境，35～37℃，18～24小时→观察细菌的生长情况，选择可疑菌落进行分离、鉴定。

答：没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求，一定程度上所有的培养基都是有选择性的。能够从自然界混杂的微生物群体中把某种细菌选择培养出来（即使这种细菌仅占少数）且为纯培养的分离技术必须通过选择培养进行。必须根据该细菌的特点，包括营养、生理和生长条件等，造就抑制非目的细菌生长或有利于目的菌生长的培养基（选择培养基）与环境生长条件，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升，然后再对它行进一步的纯培养。

答：鉴别培养基是利用细菌分解蛋白质和糖的能力以及其代谢产物的不同，在培养基中加入某些指示剂和底物，通过判断指示剂的变化了解各种细菌的生化反应，可在混杂标本中将该种微生物与其他微生物区分开来，挑取需鉴定细菌做进一步鉴定试验。鉴别培养基主要用于微生物的快速分类鉴定以及分离和筛选产生某种代谢产物的微生物菌种。例如，在SS培养基上，一些发酵乳糖的细菌菌落为红色，不发酵乳糖的细菌保持无色；将腹泻患者的粪便标本接种在该培养基，孵育后挑选不发酵乳糖无色菌落再做进一步生化反应鉴定及血清学鉴定后，检出沙门菌或志贺菌致病菌。致腹泻大肠埃希菌检测是取可疑粪便标本接种在中国蓝平板（或MAC平板或EMB平板），孵育18～24小时，挑取乳糖发酵粉红色菌落5～10个，接种于克氏双糖铁培养基（KIA）和动力、吲哚及脲酶（motility、indole、urease，MIU）培养基管，根据生化反应确定大肠埃希菌。

答：单个细菌在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多的菌落连成一片时，便形成菌苔。一个菌落中所有细胞均来自一个亲代细胞，那么这个菌落为纯培养（pure culture）。不同的细菌在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的形态和生理特征，可以成为对该种细菌进行分类、鉴定的重要依据。在进行菌种鉴定时，所用的微生物均要求为纯的培养物，即挑取单个菌落培养物进行鉴定。

答：细菌培养基是由人工配制而成的专供细菌生长繁殖使用的混合营养物制品。适宜的培养基不仅可以做细菌的分离纯化培养、传代、菌种保存，还可以用于研究细菌的生理、化学特性，是对病原菌分离鉴定的重要环节和必不可少的手段。pH可影响细胞膜通透性和稳定性、物质溶解和电离等过程。细菌代谢均为酶促反应，它需要最适的pH，从而使其保持稳定。多数细菌生长的最适pH在6.0～8.0，嗜酸性细菌最适生长pH可低至3.0，嗜碱性细菌最适生长pH可高至10.05，病原性细菌最适pH为7.0～7.6，极个别细菌如霍乱弧菌pH在8.4～9.2生长最佳。利用霍乱弧菌特殊的最适生长pH可制备选择性增菌培养液（碱性蛋白胨水），以提高粪便标本该菌检出率。

答：血琼脂培养基配制时将灭菌后的营养琼脂冷却到50℃左右，以无菌操作加入10%无菌脱纤维羊血（或兔血），立即混匀，避免产生气泡，然后以无菌操作分装于无菌试管或平皿，制成血琼脂斜面或血琼脂平板。绵羊血或兔血是微生物生长繁殖的良好营养物质，在45～55℃的基础培养基中加入血液可以保存血液中某些不耐热的生长因子，促使细菌生长繁殖，由于红细胞未被破坏，有利于观察细菌溶血特性，因此，血琼脂斜面可用于保存营养要求高的细菌；血琼脂平板可用分离培养细菌、检测其溶血性及保存菌种。

答：将灭菌后的普通琼脂培养基加热融化，在琼脂温度70～80℃时以无菌操作加入10%的无菌脱纤维羊血（或兔血）（临用前置37℃水浴预热30分钟），并在80℃水浴中摇匀15～20分钟，使血液中的红细胞破裂，释放出Ⅹ及Ⅴ因子，然后倾注平板后即成巧克力琼脂平板，用于分离培养奈瑟菌属、流感嗜血杆菌属等需要依赖Ⅹ及Ⅴ因子方能生长繁殖的对营养要求较高的细菌。凡疑有流感嗜血杆菌属、奈瑟菌属存在的标本，均应接种巧克力平板。血液标本增菌培养后有细菌生长，若移种巧克力平板上，有利于分离更多的细菌。

答：微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。因此，在微生物的研究及检验中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的 “纯洁”。防止其他微生物的混入。在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术称为无菌技术，它是保证微生物学研究、检验等正常进行的关键。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。所以，无菌技术围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括以下几个方面：①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒；②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

答：普通培养法是指需氧菌或兼性厌氧菌等在普通大气条件下的培养方法，又称需氧培养法。将接种好的平板、斜面、液体培养基置于35℃孵箱中，在普通大气条件下培养18～24小时，一般需氧菌或兼性厌氧菌即可在培养基中生长，但标本中菌量很少或难于生长的细菌（如结核分枝杆菌）需培养3～7天甚至1个月才能生长。为使孵育箱内保持一定的湿度，可在其内放置一杯水。对培养时间较长的培养基，接种后将试管口塞好棉塞或硅胶塞后用石蜡-凡士林封固，以防培养基干裂。其原理为：需氧菌是指具有较完善的呼吸酶系统，需分子氧做受氢体，只能在有氧条件下生长繁殖。兼性厌氧菌是指在有氧或无氧环境中均能生长繁殖的微生物。可在有氧或缺氧条件下通过不同的氧化方式获得能量，兼有有氧呼吸和无氧发酵两种功能。

答：在无菌条件下用接种环或接种针把细菌由一个培养器皿转接到另一个容器进行培养，或将标本中混杂的多种细菌在培养基表面分散生长的操作称为细菌接种，是细菌的分离培养与鉴定中最常用的基本操作。细菌的分离接种法有下述几种方法：①平板划线分离接种法：使标本中混杂的多种细菌在培养基表面分散生长，形成各自菌落，便于观察菌落特征与挑取单个菌落进行纯培养；②斜面接种法：主要用于已获得的单个菌落的移种、纯种培养细菌和保存菌种以及用于某些生化鉴定试验；③液体接种法：用于各种液体培养基如肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等的接种；④穿刺接种法：多用于半固体培养基或双糖铁、明胶等具有高层的培养基接种；⑤倾注平板接种法：本法用于兼性厌氧菌或厌氧菌的稀释定量培养和饮水、饮料、牛乳和尿液等标本的活细菌计数。接种技术贯穿细菌分离培养与鉴定全过程，目的是获得单个菌落或纯培养。接种技术需注意无菌操作，标识清楚。近年出现的自动化接种系统在接种技术的标准化、规范化，无菌技术以及提高工作效率等方面取得了很大进步。

答：分类是认识客观世界的一种基本方法。研究微生物分类理论和技术方法的学科称为微生物分类学。“种”是微生物分类学中最基本的分类单元和分类等级。而鉴定是指借助现有的微生物分类系统，通过特征测定，确定未知的、新发现的或未明确分类地位的微生物所应归属分类地位，是将一个未知的菌株按其生物学特性，经过与所有已知菌进行比较后划归到一个已知菌种的分析过程。常规鉴定内容有形态特征和理化特性。形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应和血清学反应等。除此之外，细菌鉴定还包括自动化鉴定和分子生物学鉴定。所以，在目前的感染性疾病诊断过程中，大多数的细菌都鉴定到 “种”这一分类等级。

答：通过分离纯化得到的细菌纯培养物，还必须通过各种保藏技术使其在一定时间内不死亡，不被其他微生物污染，不会因为发生变异而丢失重要的生物学性状，否则就无法真正保证微生物研究和应用工作的顺利进行。菌种或培养物的保藏是一项重要的微生物学基础工作，微生物菌种是珍贵的自然资源，具有重要意义。许多国家都设有相应的菌种保藏机构，例如，中国微生物菌种保藏委员会、中国典型培养物保藏中心、美国典型菌种保藏中心、荷兰的真菌中心保藏所、英国的国家典型菌种保藏中心等。国际微生物联合会还专门设立了世界菌种保藏联合会，储存了世界上各保藏机构提供的菌种数据资料，可以通过互联网查询和索取，进行微生物菌种的交流、研究和使用。

答：菌落是指细菌或真菌在适宜的培养基上繁殖后形成的肉眼可见的集合体。真菌菌落形态的观察即真菌在固体培养基上的生长表现。①酵母菌在固体培养基：菌落呈油脂状或蜡脂状，表面光滑、湿润、黏稠，有的表面呈粉粒状，粗糙或皱褶，菌落边缘整齐、缺损或带丝状，菌落颜色有乳白色、黄色和红色等。②丝状真菌在固体培养基：不同真菌在固体培养基上培养2～5天，可见真菌菌落有绒毛状、絮状、绳索状等。菌落大小依种而异，有的能扩展到整个固体培养基，有的有一定局限性（直径1～2cm或更小），很多真菌的孢子和菌丝能产生色素，致使菌落表面、背面甚至培养基呈现不同颜色，如黄色、绿色、黑色、橙色等。正是因为真菌在固体培养基上的生长表现具有一定的特征性，各种真菌在同一培养基上的菌落形状、颜色等相对稳定，故菌落特征也是鉴定真菌的重要依据之一，因此在微生物学检查时需要观察真菌菌落形态。

答：在自然基质或人工培养基上由一段（或一丛）菌丝或一个（或一堆）孢子发展而成的菌丝体的整体称菌落。丝状真菌的菌落是由分枝状菌丝组成，因菌丝较粗而长，形成的菌落较疏松，呈绒毛状、絮状或蜘蛛网状，一般比细菌菌落大几倍到几十倍。有些真菌，如根霉、毛霉、链孢霉生长很快，菌丝在固体培养基表面蔓延，以致菌落没有固定大小。有的丝状真菌菌落生长则有一定的局限性，直径1～2cm或更小。菌落表面常呈现出肉眼可见的不同结构和色泽特征，这是因为真菌形成的孢子有不同形状、构造和颜色，有的水溶性色素可分泌到培养基中，使菌落背面呈现不同颜色；一般处于菌落中心的菌丝菌龄较大，位于边缘的则较年幼。菌落具有 “霉味”又称霉菌。同一种丝状真菌，在不同成分培养基上的菌落特征可能有变化；但在同一培养基上的菌落形状、颜色等相对稳定。故菌落特征也是鉴定真菌的重要依据之一。酵母菌较丝状真菌生长快，一般培养2～3天后观察，丝状真菌培养至少4周才能确认为阴性，故孵育时间和真菌种类有关。

答：常用的真菌培养基的营养物质往往只提供真菌生长需要最低营养成分，以利于限制细菌生长而促进真菌生长繁殖，提高真菌分离率。至今仍无一种适合所有真菌生长的培养基，根据真菌种的不同选择合适培养基是临床真菌检验的重要任务。常用真菌培养基有：①沙氏葡萄糖琼脂（Sabouraud′s dextrose agar，SDA）：是基础培养基并添加各种抗生素组合包括放线菌酮、氯霉素、庆大霉素、环丙沙星、青霉素和（或）链霉素，达到抑制某些真菌、革兰阳性菌和革兰阴性菌以制备各种选择培养基；②沙氏脑心浸液琼脂（sabouraud brain heart infusion agar，SABHI）：是一种通用于所有真菌的分离培养基，可以适合对大多数真菌包括双相性真菌酵母阶段的生长，加入羊血可提供苛养真菌如荚膜组织胞浆菌生长；③马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）：促进分生孢子生长的培养基，也可用于促进皮肤癣菌色素形成；④玉米粉葡萄糖（或吐温）琼脂 [cornmeal agar with 1%dextrose（or with Tween）agar，CMA]：能促进红色毛癣菌产生深红色色素；玉米浸出液提供酵母生长基本营养物质，用吐温80取代葡萄糖可促进白念珠菌厚壁孢子及假菌丝形成，若用玻片小培养、置于微需氧环境可促进厚壁孢子形成；⑤念珠菌显色培养基（chromogenic candida agar）：是临床检验酵母菌重要选择鉴别培养基，经过37℃24～48小时的培养，根据菌落颜色可以初步提示不同种的念珠菌。

答：致病性真菌有酵母及酵母样真菌和丝状真菌，两者生物学特性、培养鉴定方法及致病性都不同，因此在临床上对常见致病性真菌的鉴定首先要区分酵母菌还是丝状真菌。如果初代培养基上培养出酵母样菌落，在鉴定前应进行分离纯化。在去除细菌和其他真菌污染，区分混合感染后，对纯菌落进行鉴定。丝状真菌的鉴定较为复杂，临床上丝状真菌的鉴定主要根据高倍镜观察孢子和菌丝的形态特征、位置、大小和排列，尤其是产孢结构。初代培养后根据形态学特征一般可鉴定到属的水平，再依据不同真菌属的鉴定要求，采用标准培养基和培养条件进一步完成菌种鉴定。

答：真菌的形态学检查是正确鉴定菌种的基本方法。为了避免挑取菌落制备涂片时破坏了真菌原有结构（孢子和菌丝的形态特征、位置、大小和排列），尤其是产孢结构，影响菌鉴定种正确性，小培养法是观察真菌结构及生长发育的最佳方法。小培养法有很多种，常用方法有下述几种。

按常规方法接种标本在试管或平皿中。取无菌11mm×11mm大小的盖玻片，加薄层培养基。将此盖玻片有培养基的面朝向接种处插入琼脂，在适当环境培养后，肉眼可见有菌生长时取出盖玻片，有菌面朝下直接覆盖在加有封固液的载玻片上，显微镜下观察。

在无菌平皿中放入无菌的U形或V形玻璃棒（或其他支持物），加适量无菌水或含水棉球。取1片无菌载玻片放于玻棒上，从平板培养基上取4～5mm厚、5mm×5mm大小的琼脂块置于载玻片上。在琼脂块的四周接种标本，然后加盖无菌盖玻片。在适宜环境中培养，肉眼发现有菌生长，提起盖玻片，移去琼脂块，分别将盖玻片和载玻片制片，显微镜观察。

在灭菌的玻片上滴加少许培养基，凝固后接种标本，加灭菌的盖玻片。放入适合的培养皿，于合适的温度培养箱中培养。为保持湿度，培养皿中放置数个盐水棉球。肉眼观察到有菌生长，即可取出在显微镜下观察。

上述3种方法均无需制备涂片，可在真菌生长后用光学显微镜观察其的原始结构形态。

答：随着临床病毒学研究的深入，发现多数感染性疾病是由病毒引起的，已证实对人有致病性的病毒达500余种，给人类健康带来极大危害，故能在病毒感染早期做出病原学诊断已成为临床实验室的任务和责任。病毒培养与鉴定技术（viral culture and identification）是指用含有病毒的标本接种活细胞或组织，病毒大量增殖获得纯种病毒后，应用传统或现代的技术方法对获得病毒的生物学特性进行鉴定分析，区分病毒的种和型。病毒培养与鉴定是病毒病原学诊断的 “金标准”，也是进行病毒药物敏感性试验的基础。因为病毒体积微小，且具有严格细胞内寄生的特点，通过病毒在活细胞内的增殖及对细胞的作用，可以根据细胞病变、细胞培养物内出现血凝素或其他病毒抗原、红细胞吸附现象及对细胞的作用等方法加以判断。根据培养过程或动物接种后的变化特征、流行病学资料和标本来源可进行初步鉴定，有助于确定病毒的种类，但常需结合血清学试验鉴定。

答：病毒的分离培养方法主要包括：①动物接种；②鸡胚接种；③细胞培养。细胞培养（cell culture）是从生物体内取出组织或细胞，在体外（in vitro）模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，对这些组织或细胞进行孵育培养，使之保持一定的结构和功能，细胞培养也称为组织培养（tissue culture），两者可作为同义语使用。细胞培养又包括传统细胞培养、离心增强快速细胞培养和遗传改造细胞培养等。传统细胞培养是病毒分离培养中最常用的方法，病毒在合适细胞系与适宜生长条件下能够在细胞中复制增殖。根据细胞来源、染色体特性及传代次数等细胞可分为：①原代细胞（primary cell）；②二倍体细胞系（diploid cellline）；③连续细胞系（continuous cell line）。由于连续细胞系对病毒敏感性稳定，易于获取和保存，广泛用于病毒分离，如Hela细胞和Hep-2细胞等。根据培养细胞的生长方式，又可将细胞培养分为单层细胞培养（monolayer cell culture）和悬浮细胞培养（suspended cell culture）。传统细胞培养具有结果可靠、敏感性高等优点，特别适用于新病毒或变异株的检测，也是抗病毒药物体外敏感性试验的基础；但传统细胞培养法对技术要求较高、检测周期相对较长，且多种病毒缺乏敏感细胞株或敏感细胞株不易获取，因此限制了其向临床实验室的推广。

答：飞片离心培养又称离心增强快速细胞培养，是在传统细胞培养基础上衍生出来的一种病毒快速分离培养方法，其原理是在飞片培养管中加入玻片，玻片上覆有单层敏感性细胞，将标本加入飞片培养管并离心，此离心步骤极大地增强了标本中病毒与玻片上细胞的吸附侵入，故能明显缩短培养时间，且敏感性也高于传统细胞培养，故被称为一种快速的病毒分离方法。其操作方法可以简单描述为：①在飞片培养管内置放一个玻片，培养管内细胞生长时会在玻片上覆有单层细胞；②将标本接种在飞片培养管内，然后将飞片培养管低速（700×g）离心40分钟，再加入适量病毒生长液，于35～37℃5%CO₂孵箱培养；③16～72小时后取出玻片，使用荧光标记的病毒单克隆抗体染色或酶染色法对玻片上的病毒进行检测。

答：遗传改造细胞培养是用遗传工程改造的细胞系对特定病毒进行培养，始用于疱疹病毒（HSV）的检测，其原理是将HSV UL97突变株的基因启动子与大肠埃希菌半乳糖苷酶（galactosidase）lacZ基因相连，稳定转染幼仓鼠肾细胞系（如BHK-21），当HSV感染细胞时，HSV的VP16蛋白和ICPO蛋白能特异性地与UL97启动子结合而诱导半乳糖苷酶的表达，加入此酶的底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）后，可在细胞中形成蓝色产物，从而指示细胞中HSV的存在。该系统的优点耗时短，在普通显微镜下观察即可，适用于疱疹病毒HSV的检测。

答：大多数病毒在敏感细胞内增殖后会引起细胞出现特有的病变效应，在显微镜下表现为细胞圆缩、溶解、融合、脱落，以及细胞内颗粒增多、形成包涵体等。不同病毒的细胞病变效应（CPE）特征不同，如腺病毒和肠道病毒等引起细胞圆缩、团聚或呈葡萄串状；副黏病毒、巨细胞细胞病毒和呼吸道合胞病毒等可引起细胞融合，形成多核巨细胞；单纯疱疹病毒、狂犬病病毒和麻疹病毒可使细胞出现胞质或核内包涵体，根据包涵体在细胞的部位、数量、形状等特点，作为可疑病毒性感染的辅助诊断。以上细胞病变均可以应用光学显微镜观察，因此可以作为病毒增殖的指标之一。

答：含有血凝素的病毒感染敏感细胞后，血凝素会出现于感染细胞膜表面，这种细胞具有吸附个别种类脊椎动物（如鸡、豚鼠和猴等）红细胞的能力，此现象称为红细胞吸附（hemadsorption，HAd），常用以检测具有血凝素的包膜病毒的存在。如流感病毒或某些副流感病毒感染单层细胞培养，虽不产生明显的细胞病变效应（CPE），但它们在受染细胞内复制时所合成的血凝素蛋白，可插入受染细胞膜中，从而使受染细胞获得吸附红细胞的能力。若在这些受染细胞培养物中加入某些动物红细胞时，红细胞便会吸附在受染细胞上。此试验可作为流感病毒或某些副流感病毒增殖的指标和初步鉴定。一些无包膜病毒尽管也具有血凝素（如腺病毒、呼肠病毒等）但其受染细胞无红细胞吸附作用。

答：流感病毒血凝试验（influenza virus hemagglutination test）又称红细胞凝集试验。含有血凝素的病毒接种鸡胚或感染细胞后，收集鸡胚组织液或细胞培养液，再向其中加入动物红细胞后可出现红细胞凝集。将含有病毒的组织液或培养液做梯度稀释后，以出现血凝反应的最高稀释度作为血凝效价，可对病毒的数量进行半定量测定。又因流感病毒包膜中除了磷脂分子之外，还有两种非常重要的糖蛋白：血凝素和神经氨酸酶。这两类蛋白突出病毒体外，长度为10～40nm，被称作刺突。一般一个流感病毒表面会分布有500个血凝素刺突和100个神经氨酸酶刺突。甲型流感病毒中血凝素和神经氨酸酶的抗原性会发生变化，这是区分病毒毒株亚型的依据。因此血凝试验特别适合流感病毒的鉴定。

（李惠）