第三节 病原体快速检测
答：过去的微生物学诊断在平板上分离获得单个菌落是鉴定的前提，然后进行菌落特点特征观察、染色形态观察、生理生化特征观察、血清学试验和药敏试验等来将细菌鉴定至属或种水平。如何快速、准确地鉴定微生物，一直是临床微生物工作者的努力目标。20世纪70年代以来，逐步发展了微量快速培养基和微量生化反应系统，实现了从生化模式到数字模式的转化，大大促进了微生物检验的自动化进程。大多数自动化鉴定系统采用细菌分解底物后反应液中pH的变化，色原性或荧光原性底物的酶解，测定挥发或不挥发酸，或识别是否生长等方法来分析鉴定细菌，与手工系统相比，自动化检验提高了阳性检出率，灵敏度高，重复性好，缩短检验周期，节省人力。
答：血清学鉴定是采用含有已知特异性抗体免疫血清（诊断血清）与纯培养细菌抗原反应，以确定病原菌的种或型。经血清学试验才能报告的细菌包括：沙门菌属、志贺菌属、霍乱弧菌、肠炎弧菌、肠出血性大肠埃希菌O157：H7和嗜肺军团菌。临床常用的方法包括凝集试验、荚膜肿胀试验和免疫荧光技术等，检测未知的细菌抗原成分，可直接使用临床标本或在细菌分离培养之后进行，该试验特异、敏感、简便，即使在是患者使用了抗菌药物之后采集标本或在细菌培养不易成功的情况下，细菌抗原仍能被检测出来，是临床微生物学检测重要的方法之一。
答：与传统的表现型方法检测相比，基因型鉴定更具特异性，大大缩短了检验周期，常用的技术有核酸杂交、核酸扩增技术和生物芯片技术。21世纪初，分子生物学检测技术成为最引人关注的细菌鉴定技术，它具有快速准确的优点，尤其是那些培养困难的微生物和血清学方法不易测出的微生物，能客观、准确、快速地应用于临床检测并广泛应用到临床微生物学实验室。但分子诊断技术尚不能代替常规微生物培养和血清学诊断，如分子诊断技术的结果可以检测到微生物的DNA或RNA，但不显示微生物的生存性（检测到DNA或RNA，微生物可能已经死亡）或微生物是否存在感染的过程。
答：16S rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中，由保守区和可变区组成，两者互相交错排列。编码rRNA基因与细菌整个基因组的变化相比，有高度的保守性。现有细菌的RNA均由其祖先一代代传下来，虽然在长期的进化过程中，由于不时突变而有较大变化，但其祖先的某些痕迹仍留在其核苷酸序列中，这种痕迹为细菌的系统进化研究提供了可能。因此，有人将rRNA基因称为细菌的 “化石”。这一 “化石”的存在，为细菌的研究提供了方便。由于16S rRNA基因核苷酸序列总长度适宜，结构完整，更便于对细菌进行各种研究。设计一对引物，以16S rRNA基因为靶分子在适当条件下进行PCR扩增，便得到扩增后的16S rRNA基因片段，用链终止法或化学降解法对片段进行测序，并与基因库中的片段比对，便得知未知菌与基因库中其他菌的相似性，从而完成对菌的鉴定，其特征性的核苷酸序列是不同分类级别生物（如科、属、种）鉴定的分子基础。当鉴定同源性很高的菌种时，可以用生理生化实验或其他方法作为补充，但16S rRNA基因序列分析在分类学中的地位是无法代替的。
答：不同的微生物表达其特异性的基因产物。蛋白质组学技术的迅速发展使得可以通过对微生物基因产物主要是蛋白质进行分析，鉴定其种属类别。蛋白质组学的常用技术包括蛋白质的分离和鉴定两部分，目前应用最广泛主要有双向凝胶电泳和质谱技术是。蛋白质组学研究中通过标本制备取得感兴趣的蛋白质点，运用质谱分析确定肽指纹图谱或部分氨基酸序列并利用生物信息学数据库确定。蛋白质谱技术（mass spectrometry）是对目的蛋白质进行分析、检测和鉴定，是近年来蛋白质组学发展起来的重要手段。其基本原理是将标本分子离子化后，根据不同离子间质荷比的差异来分离并确定相对分子质量，根据这些信息借助相应的蛋白序列数据库与已有的蛋白信息比较从而鉴定蛋白的性质，对微生物进行鉴定和分类。以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）为代表的质谱技术正在微生物诊断领域，特别是病原微生物特异性产物（如毒素）的快速检测和鉴定方面发挥重要作用，鉴定结果准确、快捷。
答：21世纪初，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定技术和16S rRNA基因测序技术一样是引人关注的细菌鉴定技术。质谱技术是利用特定离子源将待测标本各组分发生电离，形成高速运动的离子。离子进入质量分析器后，在电场或磁场作用下，根据质荷比不同而进行分离，用检测器记录各离子流的相对强度，形成质谱图用于分析。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定技术是通过建立各种细菌具有种属特征的化学物质，如脂肪酸、蛋白质、核酸、糖类等特征指纹图谱库，将临床分离的单个细菌菌落经简单的前处理后，直接上机检测，所获得的质谱图可立即与数据库进行比较，得出鉴定结果。质谱技术整个鉴定过程无需做革兰染色、氧化酶试验等，仅需几分钟，操作简单、快速，高通量，被称之为细菌鉴定的革命。
答：内毒素的临床检测常用鲎试验法，有半定量和定量测定两种方法。半定量测定采用凝胶法，定量测定采用浊度法（比浊法）与显色基质法（显色法）。鲎试验原理是利用内毒素可使鲎（一种低温海洋动物）血变形细胞中C因子激活，活化的C因子再激活B因子，然后激活凝固酶原，最后促使凝固蛋白原转为凝固蛋白，从而检出微量细菌内毒素的存在。细菌非培养快速检验是指除细菌的直接分离培养和鉴定外的细菌感染性疾病的病原学检测方法，检测微生物的毒力，是临床细菌学检验重要的手段，为一种常用的细菌非培养快速检验方法。目前国内外广泛用于内毒素败血症、菌尿症、革兰阴性菌脑膜炎等的快速早期诊断，也用于食品检验和部分药品细菌内毒素限度的检验，具有快速、简便、灵敏的特点。
（李惠）