第三章　病原检验技术

第一节　显微镜检查

答：明视野显微镜的照明光线直接进入视野，属透射照明。活的细菌在明视野显微镜下观察是透明的，不易看清。而暗视野显微镜则利用特殊的聚光器实现斜射照明，标本照明的光不直接穿过物镜，而是由标本反射或折射后再进入物镜，因此，整个视野是暗的，而样品是明亮的。正如我们在白天看不到的星辰却可以在黑暗的夜空中清楚的显现一样，在暗视野显微镜中由于标本与背景的反差增大，可以清晰地观察到在明视野显微镜中不易看清的活体菌等透明的微小颗粒。而且，即使所观察的微小颗粒的尺寸小于显微镜的分辨率，依然可以通过它们散射的光而发现其存在。因此，暗视野法主要用于观察活的微生物，即不染色微生物的运动。

答：光线通过比较透明的标本时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）都没有明显的变化，因此，用普通的光学显微镜观察未经染色的标本（如活的细胞）时，其形态和内部结构往往难以分辨。然而，由于细胞的各部分折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，折射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。光的相位差人肉眼感觉不到，但相差显微镜配备有特殊的光学装置环状光阑和相差板，利用光的干涉现象，能将光的相位差转变为人眼可以觉察的振幅差（亮度差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强。由于标本的这种反差是以不同部位的密度差别为基础形成的，因此，相差显微镜使人们能在不染色的情况下比较清楚地观察到在普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或者看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构，适于观察微生物形态、内部结构和运动方式。

答：细菌形态学检查（morphological examination of bacteria）是细菌学检验中极为重要的基本操作之一，包括不染色标本检查法和染色标本检查法。显微镜是观察细菌形态必备的基本工具，在培养前镜检不仅可以迅速了解标本中有无细菌及大致菌量，而且可以根据细菌形态、结构和染色性初步识别病原菌，它不仅确认标本中的细菌存在与否又可提示分离培养检出菌的所用培养基和培养条件，为进一步的培养提供依据。某些细菌感染性疾病通过形态学检查可得到初步诊断，可作为开始抗感染治疗的依据。痰液中的抗酸杆菌和泌尿生殖道分泌物中的淋病奈瑟菌等通过形态学检查，可得到初步诊断，对临床早期诊断和治疗疾病有一定的参考意义，但大多则需要进一步做细菌培养和鉴定才能确诊，同时依据体外药敏试验结果使用抗菌药物。

答：采用压滴法、悬滴法在明视野、暗视野或相差显微镜下对微生物活体进行直接观察，这种方法被称为不染色标本观察。由于细菌未染色呈半透明状，因而依靠细菌和周围环境的折光率差别进行观察。其特点是可以避免一般染色制样时的固定作用对微生物细胞结构的破坏，并可用于专门研究微生物的运动能力及生长过程中的形态变化，如细胞分裂、芽胞萌发等动态过程。细菌如有动力，可看到细菌自一处移至另一处，有明显的方向性位移；细菌如无动力，受水分子撞击细菌呈现布朗运动，只在原地颤动而无位置的改变。

答：细菌、真菌、原生动物和其他微生物体积小且细胞质透明，不借助染色方法很难观察到这些微生物。在光学显微镜下，细胞体液及结构的遮光率与其背景相差很小，因此用压滴法或悬滴法进行观察时，只能看到其大体形态和运动情况。若要在光学显微镜下观察其细致形态和主要结构，一般都需要对它们进行染色，借助颜色的反衬作用提高观察标本不同部位的反差。染色方法可以是简单染色或负染法（一步法），也可以是鉴别染色法（多步法），如革兰染色或抗酸染色，便于更清楚地看到它们的形态特征。

答：临床皮肤真菌标本的检查目前仍以形态学为主，直接镜检法检查真菌因其简便、快速而广为应用。大部分的皮肤感染真菌属丝状真菌，真菌镜下检查阳性（即镜下查到真菌结构成分-真菌细胞形状、孢子与菌丝）可确定感染。丝状真菌各菌种因有较明确分化的菌丝和孢子，鉴定以形态学为主，必要时进行一些特殊试验。直接显微镜法适合于皮肤、黏膜、趾甲或断发残根标本观察皮肤真菌。将一小块标本放在清洁的玻片上，加10%～20%的氢氧化钾1～3滴，在酒精灯上来回移动加热数秒，加上盖玻片，或加上盖玻片后放置室温15分钟左右，待标本溶解。先用低倍镜观察，再换高倍镜观察，观察是否有菌丝、孢子等。黏膜和小组织块标本放在玻片上加生理盐水数滴，加盖玻片后在显微镜下观察。

答：大多数病毒颗粒不能在光学显微镜下见到，但是某些病毒感染后，宿主细胞内可形成在光学显微镜下可见到的包涵体。一般认为，有的包涵体是病毒的团聚，另一些包涵体则是病毒与宿主细胞相互作用的细胞反应产物。根据包涵体形成的部位可分为胞质内及核内包涵体；根据染色性又可分为嗜酸性或嗜碱性包涵体。由于病毒种类不同，包涵体存在的部位及染色性也可以不同。因此，包涵体的检查对诊断某些病毒性疾病具有一定价值。狂犬病病毒对神经组织有较强亲嗜性，在易感动物或人的中枢神经细胞增殖时，可在胞质内形成嗜酸性、圆形或椭圆形的包涵体，直径为3～10μm，称内基小体（Negri body），即为其废弃的蛋白质外壳在细胞内聚集形成的嗜酸性颗粒，内基小体广泛分布在患者的中枢神经细胞中，是该病实验室诊断的一个指标。因其体积较大，故可以用光学显微镜观察，通过病理组织学染色观察内基小体是一种经典的实验室诊断方法。

答：片形吸虫主要包括肝片形吸虫和巨（大）片形吸虫两种。两种片形吸虫的生活史相似，包括成虫、虫卵、毛蚴、胞蚴、雷蚴、尾蚴、囊蚴、童虫阶段。成虫产出的虫卵随胆汁进入肠腔，随粪便排出体外落入水中；在水中孵出毛蚴，遇中间宿主椎实螺，侵入其体内，经胞蚴、雷蚴的发育和增殖，产生许许多多的尾蚴；尾蚴逸出螺体，在水中或水生植物表面结囊，形成囊蚴。囊蚴在终宿主小肠内逸出童虫穿过肠壁进入腹腔，再侵入肝中，在肝实质穿行，经数周或数月，童虫才侵入胆管，发育为成虫后产卵。片形吸虫病临床上分为急性期、潜隐期和慢性期3个时期。急性期也称侵袭期，由童虫侵入腹腔和肝引起腹膜炎和创伤性肝炎所致，此时期主要是童虫移行串扰引起，还未发育到成虫阶段，所以在粪便标本中查不到虫卵。

答：我国仅有日本血吸虫分布，其生活史包括成虫、虫卵、毛蚴、母胞蚴、子胞蚴、尾蚴和童虫等阶段。血吸虫成虫雌雄异体终生呈合抱状态，在静脉末梢产卵，所产虫卵沉积于肝及肠壁组织，约经11天，虫卵发育成熟，虫卵内有发育成熟的毛蚴，毛蚴的分泌、排泄物透过卵壳微孔释出，引起卵周围组织炎症及变态反应，形成以虫卵为中心，淋巴细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及浆细胞，以及抗原抗体复合物形成的虫卵肉芽肿。肉芽肿随之液化坏死，而出现嗜酸性脓肿。沉积于肠壁组织的虫卵，由于肠蠕动、腹内压和血管内压的作用，随肉芽肿所致嗜酸性脓肿溃破脱入肠腔，混入粪便排出体外。血吸虫病属虫卵随粪便排出的寄生于消化道外的寄生虫感染，可以用粪便涂片镜检来诊断。

答：薄、厚血膜同片制作法是在同张载玻片制作患者外周血液的薄血膜与厚血膜，经染色后镜检，是鉴别疟原虫的虫种与虫期，确诊疟疾的依据。

用血量少、镜下红细胞完整、疟原虫形态典型、便于观察，有利于疟原虫的检查与虫种鉴定，可区分出感染人体的四种疟原虫（间日疟原虫、三日疟原虫、恶性疟原虫和卵形疟原虫），但费时、检出率低。

血量多而集中、省时、准确性高（镜检的敏感性可达疟原虫10～20个疟原虫/μl），厚血膜片的疟原虫比较集中（一个视野可见到的细胞数约相当于20个薄血膜视野），但厚血膜在制片过程中红细胞已经被溶解，红细胞轮廓消失，原虫皱缩变形，虫体比薄血膜中的略小，有的原虫胞质着色很深，胞核模糊不清，初学者较难识别，检验人员必须经过一段时间的严格训练，在掌握薄血膜中各种疟原虫的形态特征后，才能认清厚血膜中的疟原虫。因此，采用厚、薄血膜同片制作法，更有利于检查与鉴定疟原虫虫种，在同一片时应先检查厚血膜上的疟原虫，如鉴定虫种有困难，可再仔细观察薄血膜，以提高镜检效果。

答：包虫病又称多房棘球蚴病，主要由细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的幼虫寄生人体和动物体内引起。细粒棘球绦虫棘球蚴感染引起的称为囊型包虫病，多房棘球绦虫棘球蚴感染引起的称为泡型包虫病，两者所造成的损害均为占位性病变和压迫症状。棘球囊蚴囊一旦破裂，囊内容物进入人体腔或其他组织引起继发性棘球蚴病或急性炎症反应；若棘球蚴液溢出可引起严重的过敏反应而致休克，甚至死亡。在诊断穿刺时，防止内容物渗出以免形成继发性棘球蚴病或过敏反应。按照传统理论，对疑似患者禁止作诊断性穿刺以免引发并发症。但是近年的研究表明，应用B超引导下的细针肝脏穿刺，并结合服用杀虫药物，诊断性穿刺检查疑似棘球蚴病例还是相当安全的。需要注意的是如果患者IgE抗体高和（或）有过敏史、或棘球蚴囊较大且位于脏器表面并且（或）囊液压力高，不可进行诊断性细针穿刺检查。为了防止穿刺引发继发性棘球蚴感染，在穿刺检查前4天要行阿苯达唑治疗，若证实是棘球蚴则要在穿刺后继续用阿苯达唑治疗1个月。

答：寄生人体的利什曼原虫主要有杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫、热带利什曼原虫、墨西哥利什曼原虫等，我国主要有杜氏利什曼原虫和婴儿利什曼原虫。利什曼原虫有2个生活史时期，一是在白蛉体内的前鞭毛体时期，虫体呈梭形，有一根前鞭毛；一是在人、犬科动物或啮齿动物体内的无鞭毛体时期，又称利-杜小体，虫体呈卵圆形。当感染白蛉叮吸人血时，其口器中的前鞭毛体侵入人体，被巨噬细胞吞噬，鞭毛消失，变成无鞭毛体，行分裂增殖，形成许多无鞭毛体，胀破巨噬细胞，再侵入新的巨噬细胞。穿刺检查是利什曼原虫感染查找病原体的首选方法，穿刺物涂片成功率高。骨髓穿刺涂片，多选择髂骨穿刺，婴幼儿多选择胸骨穿刺，原虫检出率达80%～90%；淋巴结穿刺要选择肿大的淋巴结，多以腹股沟、颈部、肱骨上滑车等部位淋巴结，其检出率仅46%。脾脏穿刺检出率较高，达90%～99.3%，但极不安全，一般不用。因此，从安全与检出率两方面考虑，以骨髓穿刺涂片法最为安全、最为常用。

答：不用粪便检查蛲虫、旋毛虫虫卵的原因如下：

成虫寄生于人体肠腔内，主要在盲肠、结肠及回肠下段寄生。雌雄交配后，雄虫很快死亡而被排出体外；雌虫子宫内充满虫卵，在肠内温度和低氧环境中，一般不排卵或仅产很少虫卵。当宿主睡眠，肛门括约肌松弛时，雌虫向下移行至肛门外，产卵于肛门周围和会阴皮肤皱褶处，不在粪便里，因此不能用粪便检查虫卵的方法诊断。一般采用透明胶纸法或棉签拭子法在肛门周围黏取虫卵检查。

感染是由于人生食或半生食寄生有旋毛虫肌幼虫囊包的动物肉引起。肌幼虫在胃液的作用下被消化脱囊释放出来，钻入十二指肠及空肠上段的肠黏膜内，寄生在肠黏膜上皮细胞细胞龛内，经过4次蜕皮在36小时后发育为成虫，并进行雌雄交配，96小时后产出新生幼虫（胎生，不产虫卵）。新生幼虫随淋巴和血液循环到达各组织、器官或体腔，但只有到达骨骼肌的幼虫才能继续发育，并以膈肌、舌肌、咽喉肌、胸肌和腓肠肌等活动频繁、血液丰富的部位多见，幼虫刺激肌细胞，约在感染后21天左右形成成熟包囊（内含肌幼虫），主要用肌肉活检法检查囊包。因此，不用粪便检查虫卵的方法诊断寄生在肠道内的旋毛虫成虫。

（李惠　吴秀萍　陈家旭）