第一章　细菌的结构与L型细菌

第一节　细菌的组成与结构

微生物产生耐药性的机制与其结构相关。主要反映在四个方面：一是有些表面结构能减少药物的吸收，如真核与原核细胞型微生物的细胞壁屏障或细胞膜通透性的改变，阻止药物的吸收，使药物无法进入微生物体内发挥作用；二是微生物的表面可作为药物的靶点结构发生改变，使药物与微生物不能结合或亲和力降低；三是有些微生物的表面结构，主要指细菌胞质膜上的外排泵系统（efflux pump system），能将已吸收入菌体的药物泵出体外，使药物浓度不足以发挥抗菌作用；四是细菌生物膜的形成，细菌形成微菌落（microcolony），被丰富的外多聚糖（exopoly saccharide）所包围，微菌落表面相互黏附形成生物膜，生物膜内的细菌对抗生素产生耐药性。

细菌等原核微生物的表面结构是由外黏液层、细胞壁和胞质膜组成，允许营养物质和排泄物通过。但对有害物质，如对抗生素等药物具有屏障作用。本章将介绍与细菌通透性相关的包绕在细菌胞质外的所有表层膜结构，包括胞质膜、细胞壁和荚膜等（图1-1）。革兰阳性（G+）菌细胞壁较厚，但结构简单，由肽聚糖和磷壁酸交联成网状结构，对多数抗生素有通透性；而革兰阴性（G-）菌细胞壁薄，但结构复杂，在肽聚糖层外尚有脂蛋白、脂质双层和脂多糖等多层结构（称外膜），可阻挡亲水性和疏水性抗生素。

一、革兰阳性菌

革兰阳性菌细胞表面由内到外分别为胞质膜、细胞壁。

（一）细胞壁

细胞壁为细菌表面比较复杂的结构。革兰阳性菌细胞壁是一层较厚（20～80nm）、质量均匀的网状结构，坚韧而有弹性，可承受细胞内强大的渗透压而不破坏。主要成分是 肽聚糖（peptidoglycan），肽聚糖含量丰富，有15～50层，每层厚度1nm，约占细胞壁干重的50%～80%。细胞壁的机械强度有赖于肽聚糖的存在，而合成肽聚糖是原核生物特有的能力。肽聚糖是由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸两种氨基糖经β-1，4糖苷键交替连接间隔排列形成的多糖支架。在N-乙酰胞壁酸分子上连接四肽侧链，侧链之间再由五肽交联桥联系起来，组成一个机械性很强的三维网状结构。各种细菌细胞壁肽聚糖的多糖支架均相同，但四肽侧链的组成及其连接方式随菌种而异。例如葡萄球菌的四肽侧链由L-丙氨酸、D-谷氨酸（或D-异谷氨酸）、L-赖氨酸和D-丙氨酸组成。交联桥是一条5个甘氨酸的肽链，交联时一端与一条侧链第三位上赖氨酸连接，另一端与另一相邻侧链第四位上丙氨酸连接。葡萄球菌的交联桥较长，有可塑性，使远距离的侧链间也可交联，交联率达90%，形成坚固致密的三维立体网状结构（图1-2）。

革兰阳性菌细胞壁的成分除肽聚糖外，尚有大量特殊组分 磷壁酸（teichoic acid），磷壁酸是由核糖醇（ribitol）或甘油（glyocerol）残基经由磷酸二酯键互相连接而成的多聚物，穿插于肽聚糖层中。磷壁酸按其结合部位不同分为壁磷壁酸（wall teichoic acid）和膜磷壁酸（membrane teichoic acid）两种，前者的一端与细胞壁中肽聚糖的N-乙酰胞壁酸共价连接，另一端则游离伸出细胞壁外。后者的一端与胞质膜外层上的糖脂键相连接，另一端向外穿透肽聚糖层的网格而游离于细胞壁外。膜磷壁酸又称脂磷壁酸（ipoteichoic acid）（图1-3），磷壁酸抗原性很强，是革兰阳性菌的重要表面抗原，在离子通过肽聚糖层中起调节作用，也可能与某些酶的活性有关；某些细菌的磷壁酸，能黏附在人类细胞表面，其作用类似菌毛，可能与致病性有关。

此外，某些革兰阳性菌细胞壁表面还有一些特殊的表面蛋白，如A族链球菌的M蛋白和金黄色葡萄球菌的A蛋白等，均与致病性和抗原性有关。

（二）胞质膜

胞质膜是包绕在细菌胞质外的具有弹性的半渗透性脂质双层生物膜。主要由磷脂及蛋白质构成，不含胆固醇是与真核细胞膜的区别点。胞质膜有选择性通透作用，与细胞壁共同完成菌体内外的物质交换。膜上有多种呼吸酶，参与细胞的呼吸过程。膜上有多种合成酶，参与生物合成过程，如 青霉素结合蛋白（penicillin-binding protein，PBP）是参与细胞壁肽聚糖合成的酶蛋白（转肽酶或转糖基酶），也是青霉素作用的靶位，青霉素与PBP结合，能与细菌竞争合成肽聚糖所需的酶，破坏细胞壁肽聚糖的合成。PBP也与耐药性有关。细菌胞质膜可以形成特有的结构，如 中介体（mesosome）。中介体与细菌分裂有关，起着类似真核细胞有丝分裂时纺锤丝的作用。另外中介体扩大了胞质膜的表面积，相应增加了呼吸酶的含量，可为细菌提供大量能量，其功能类似真核细胞的线粒体。

二、革兰阴性菌

（一）细胞壁

革兰阴性菌细胞壁与革兰阳性菌细胞壁不同，其组成与结构复杂，由内向外分别为肽聚糖层、周浆间隙和外膜。

1.肽聚糖层

厚度较薄，仅1～2层，约10～15nm，约占细胞壁干重的5%～20%。以大肠埃希菌为例，其肽聚糖的四肽侧链中第三位的氨基酸被二氨基庚二酸（DAP）所取代，并以肽键直接与相邻侧链中第四位的D-丙氨酸相连，且交联率低，因没有五肽交联桥，因而只形成疏松的二维平面结构（图1-4）。

2.胞周质间隙（periplasmic space）

在革兰阴性菌的胞质膜与细胞壁之间有一空间，称为周质间隙。此处聚集了若干种胞外酶，主要是水解酶，与营养物质的分解、吸收和运转有关，能破坏某些抗生素的酶（如青霉素酶）亦集中在此间隙内。周质间隙中有一种辅助蛋白（连接蛋白），存在于内、外膜之间，能将内膜上的外排转运蛋白和外膜上的微孔蛋白连接起来，组成主动外排系统。细菌的多重耐药性与外排泵系统对药物的排除有关。

3.外膜（outer membrane，OM）

位于细胞壁肽聚糖层的外侧，包括脂蛋白、脂质双层、脂多糖三部分。

（1）脂蛋白（lipoprotein）：

一端以蛋白质部分共价键连接于肽聚糖的四肽侧链上，另一端以脂质部分经共价键连接于脂质双层的磷酸上。其功能是稳定外膜并将之固定于肽聚糖层。

（2）脂质双层：

结构类似胞质膜，其中有微孔蛋白（porin）形成的约1nm的微孔，微孔蛋白有OprC、OprD（OprD2）、OprE、OpeF、OprG、OprH和OpeM等，可允许水溶性分子通过。有一些抗生素可通过微孔蛋白进入菌体内抑制细菌的生长繁殖，外膜微孔蛋白的缺乏是细菌耐药机制之一。

（3）脂多糖（lipopolysacchride，LPS）：

由脂质双层向细胞外伸出，包括脂质A、核心多糖和特异多糖三个组成部分，习惯上将脂多糖称为细菌内毒素。①脂质A：是脂多糖的毒性部分及主要成分，为一种糖磷脂，是由焦磷酸键联结的氨基葡萄糖聚二糖链，其上结合有各种长链脂肪酸。为革兰阴性菌的致病物质。无种属特异性，各种革兰阴性菌内毒素引起的毒性作用都大致相同。②核心多糖：位于类脂A的外层，由己糖、庚糖、2-酮基-3-脱氧辛酸（KDO）、磷酸乙醇胺等组成。经KDO与类质A共价联结。核心多糖具有属特异性，同一属细菌的核心多糖相同。③特异多糖：在脂多糖的最外层，是由数个至数十个低聚糖（3～5单糖）重复单位所构成的多糖链。特异多糖是革兰阴性菌的菌体（O）抗原，各种不同的革兰阴性菌的特异性多糖种类及排列顺序各不相同，从而决定了细菌抗原的特异性（图1-5）。另外，革兰阴性菌细胞壁薄，但结构复杂，在肽聚糖外有多层结构构成的外膜包括脂蛋白、脂质双层和脂多糖，可阻挡亲水性和疏水性抗生素，即革兰阴性菌具有选择性低通透性的外膜屏障，故对多种抗菌药物产生耐药性。如鼠伤寒沙门菌等革兰阴性菌在接触抗生素后可改变外膜孔蛋白的组成或减少蛋白通道的数量，如缺乏外膜蛋白OmpF和OmpC的表达，降低外膜通透性产生耐药性。又如铜绿假单胞菌也因缺乏特异的外膜蛋白OmpD2，而对亚胺培南等产生耐药。

（二）胞质膜

革兰阴性菌胞质膜与革兰阳性菌胞质膜在结构及组成上都没有什么区别，只是很少形成中介体。相对应革兰阴性菌的外膜而言，通常称胞质膜为内膜。革兰阴性菌胞质膜上具有外排转运蛋白，与细胞壁脂质双层上的外膜孔道相对，加上在周质间隙中的辅助蛋白（连接蛋白）协调内外膜之间的相互作用，构成药物的外排泵系统。药物通过孔道跨越细胞壁外膜，扩散于周质间隙，然后进入胞质膜的双层结构。位于脂质双层中的外排转运蛋白可捕获药物分子，在辅助蛋白协调下通过外膜孔道将药物泵出（图1-6）。细菌胞质膜上外排泵的表达水平不断提高，能主动将扩散入菌体内的抗生素或底物泵出细胞外，从而使细菌获得耐药性。

革兰阴性菌由多种胞质膜蛋白、外膜蛋白和辅助蛋白（信号肽酶或伴侣蛋白）等组成蛋白分泌系统，该系统参与合成蛋白质的分泌过程。根据其分泌功能与参与成分不同，分为Ⅰ～Ⅴ型分泌系统（图1-7）。研究较为深入的是Ⅰ～Ⅲ型分泌系统。如大肠埃希菌Ⅰ型分泌系统可分泌α-溶血素，Ⅰ型系统需要胞质膜ATP酶、外膜蛋白和膜融合蛋白等参与；Ⅱ型分泌系统主要是革兰阴性菌分泌胞外酶，该系统分泌与运送这些酶蛋白通过外膜需要通过Sec途径，需ATP酶、多聚外膜蛋白组分的参与；Ⅲ型分泌系统是许多革兰阴性菌分泌致病性蛋白质的主要途径，编码Ⅲ型分泌系统的基因位于毒力质粒和染色体致病岛区域内，称Ysc基因，表达的Ysc蛋白质包括ATP酶、伴侣蛋白、多聚外膜蛋白和胞质膜蛋白等，组成注射器样结构，把细菌毒性蛋白注入宿主细胞。

另外，革兰阳性和阴性菌中广泛存在着双组分信号转导系统（two-component signal transduction），该系统由感受器激酶和效应调控蛋白组成，感受器激酶的膜外配体能接受环境信号的作用，通过膜上蛋白的磷酸化将信号传递到效应调控蛋白，产生调控反应，以适应各种环境的变化，这不仅能参与细菌的基本生命活动，而且与细菌的毒力和致病性相关。

三、荚膜

荚膜（capsule）是某些细菌细胞壁外围一层较厚的黏性、胶冻样物质，其厚度在0.2µm以上，普通显微镜可见，与四周有明显界限，称为荚膜。如肺炎链球菌的荚膜。其厚度在0.2µm以下者，于光学显微镜下不能直接看到，必须以电镜或免疫学方法才能证明，称为 微荚膜（microcapsule），如伤寒沙门菌的Vi抗原及大肠埃希菌的K抗原等。大多数细菌（如肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌等）的荚膜由多糖组成。链球菌荚膜为透明质酸；少数细菌的荚膜为多肽（如炭疽杆菌荚膜为D-谷氨酸的多肽）（图1-8）。细菌一般在机体内和营养丰富的培养基中才能形成荚膜。有荚膜的细菌在固体培养基上形成光滑（S）型或黏液（M）型菌落，失去荚膜后变为粗糙（R）型菌落。荚膜并非细菌生存所必需的，如荚膜丢失，细菌仍可存活。

荚膜能保护细菌免遭吞噬细胞的吞噬和消化作用，因而与细菌的毒力有关。荚膜抗吞噬的机理还不十分清楚，可能由于荚膜黏液层比较光滑，不易被吞噬细胞捕捉之故。荚膜贮留水分使细菌抗干燥，并对其他因子（如溶菌酶、补体、抗体、抗菌药物等）的侵害有一定抵抗力。多糖荚膜（capsule polysaccharide，CPS）是细菌以及真菌的一个重要的毒力因子。抗微生物多肽和蛋白（antimicrobial peptides and proteins，APs）具有多种活性，可以抵抗革兰阴性和阳性菌、真菌和一些包膜病毒。具有荚膜的细菌，CPS对APs的抵抗性是该菌的一种普遍特性，在抵抗APs的众多机制中最重要的是膜表面修饰，革兰阴性菌已经发生了一系列的变化来抵抗Aps，特别是LPS分子改变。目前研究表明CPS可以抵抗补体介导的杀伤功能和中性粒细胞介导的吞噬作用。然而，如果LPS缺乏O抗原，那么对APs的抵抗作用也会减少。研究表明，肺炎克雷伯菌CPS突变株对Aps的作用比野生株更加敏感，结合多黏菌素B的能力也更强。值得注意的是，CPS可以限制APs与细菌表面相互作用，CPS对APs的抵抗能力不是与CPS的血清型和化学组成有关，而是依赖于各菌株所表达的CPS的含量。而且这些细菌的CPS表达量要超过一定的阈值才具有抵抗能力。推测对有害物质如抗生素和APs的应答可诱导肺炎克雷伯菌上调CPS的表达，使肺炎克雷伯菌对APs具有更强的抵抗力。