5.5　红茂草生物碱提取物TLC检测及相关测定

5.5.1　材料与方法

（1）材料

①药物及试剂

红茂草干草粉末（采集规范化种植的红茂草，自然风干，粉碎过80目筛）、柱层析用（200～300目）中性Al2O3（Sinopharm Chemical Reagent Co.，Ltd产品）、碘化铋钾溶液、硅钨酸溶液、苦味酸溶液、无水乙醇、95%乙醇、活性炭、氯仿、两种红茂草提取物、冰乙酸、苯、甲酸、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇、乙酸乙酯、吡啶、三重蒸馏水、浓氨水、CMC-Na、KOH、硅胶G等所用药品均为国产或进口分析纯。

②主要仪器

RE52-99型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、KQ-500D型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公式产品）、AB104-S型精密电子分析天平（瑞士梅特勤公司产品）、UV-9200型紫外可见光分光光度计（北京瑞利仪器分析有限公司产品）、SGWX-4型显微熔点仪（上海精密科学仪器有限公司）、JM-628型便携式数字温度计（天津今明仪器有限公司）、Vario EL Ⅲ型元素分析仪（德国elementar公司产品）、Pyris Diamond TG/DTA型热重/差热综合热分析仪（Perkin Elmer Precisely产品）、Lambda 35型紫外可见光光度计（Perkin Elmer Precisely产品）、Spectrum one B型傅立叶变换红外光谱仪（Perkin Elmer Precisely产品）、YP-2型压片机（上海山岳科学仪器有限公司产品）、Agilent 5973N型气-质联用仪（美国Agilent Technologies公司产品）、石英色谱柱、层析缸、玻璃片、玻璃棉、研钵、涂布器等。

（2）方法

①红茂草原草粗提

准确称取红茂草干草粉末250g，置于3000mL锥形瓶中，加入400mL 95%乙醇，振荡摇匀，封口浸泡2～3d。超声波振荡1h后，减压抽滤。将滤液转入旋转蒸发器中，40℃减压浓缩至约20mL，加15mL/L无水乙醇，封口静置1～2d，容器底部有棱柱状白色晶体析出。将此溶液常压过滤、结晶，并进行重结晶处理，得到15mg白色晶体Ⅰ。

②石英色谱柱层析

a.样品的制备　将红茂草乙醇浸泡液进行常压过滤，然后转入旋转蒸发器中，40℃减压浓缩至无醇味，加热溶液，趁热放入少许活性炭脱色，封口静置、过夜。

b.装柱　取一根内径2～3cm，长约80cm的石英色谱柱，固定在铁架台上，下端用活塞封住。采用干法装柱，将活化处理过的柱层析用（200～300目）中性Al2O3倒入柱中，在硬表面上振动填实，并使柱顶平整，再覆盖一层玻璃棉。

c.上样　向柱内加入洗脱剂氯仿，使洗脱剂缓慢渗透柱内支撑体，打开柱子下端活塞，使洗脱剂的水平面稍稍低于支撑体的顶部，再将待分离的样品小心的倾入柱的上部，然后缓慢加入洗脱剂。

d.淋洗　用氯仿进行洗脱，流速控制在20滴/min，在洗出液末段得到一组馏分。收集合并相同馏分，经减压浓缩至15mL，滴加3mL 40%NaOH溶液，静置2～3d，观察到有白色晶体析出。进行减压抽滤、干燥，得到30mg白色晶体Ⅱ。

③红茂草提取物化学成分预试实验

采用试管预试法，重复3次检测红茂草两种提取物中是否含有生物碱，依据其成分的特征性显色反应和沉淀反应，结合其特征理化性质与色谱结果进行综合分析判断。

④TLC检测

a.样品的制备　将用95%乙醇浸泡的红茂草原液及后来制得的两种提取物，做为实验所需的样品。

b.硅胶G薄板的制备　用电子分析天平称取CMC-Na 0.5023g，加蒸馏水调制成0.5%的溶液。再粗称30g薄层层析用硅胶G 30g放入研钵，加入配制好的CMC-Na溶液，并在研钵中搅拌均匀、黏稠适中。薄板[（2～3）cm×（10～12）cm，厚度0.5cm的玻璃板]用肥皂粉洗涤干净、晾干，将硅胶G糊倒入涂布器涂布薄板，控制薄板的厚度为0.25mm，于室温下晾干。使用前置于烘箱中经110℃活化2h，备用。

c.点样　用100μL的移液器吸取取经旋转蒸发器浓缩后的原液及两种晶体的95%乙醇溶解液各3～4μL，分别点于距薄层板下边缘8mm的位置，点样斑点的直径为1～2mm。

d.展开剂　根据实验的不同要求，各种展开剂临用时配制。

e.展层　将点样后的薄层玻板置于展开剂饱和的层析缸中，点样点勿浸入展开剂中，静置展开，待展开8cm时，从层析缸中取出层析薄板。

f.显色　从层析缸中取出的玻板，在展开剂未挥发之前，置于UV-9200型紫外可见光分光光度计下观察，记录显色荧光点的颜色，并计算比移值（Rf）。

⑤红茂草提取物显微熔点测定

各取少量两种红茂草提取物晶体，先后放入SGWX-4型显微熔点仪中，启动加热开关，在显微镜下观察晶体变化情况。随着温度的升高，当达到一定温度时，突然发现晶体融化，记录此时的温度，即为该样品的熔点。

⑥红茂草提取物元素测定

a.测试条件　测量范围C 0.03～20mg、H 0.03～3mg、N 0.03～2mg；分析精度≤0.3% abs（5mg苯磺酸）；分解温度950～1200℃（锡容器燃烧时达1800℃）。

b.测定　将两种提取物送兰州大学分析测试中心，采用Vario EL Ⅲ型元素分析仪，做相关的元素分析测定。使用了良好的杜马法高温分解及气体动态分离技术以及最佳的检测手段，使样品在元素分析仪中完全燃烧，有机物中的碳、氢、氮三种元素，经催化氧化-还原后，分别转化成二氧化碳、水蒸气、氮气，然后在载气的推动下用色谱法将混合气体分离后，用热导检测器分别测定各组分的响应信号值，根据组分的信号值和对应元素的校正曲线，分别计算样品中各种元素的含量。

⑦红茂草提取物热重/差热综合测定

a.测试条件　测量质量（样品质量）最大200mg（卧式差动平衡法）；温度范围室温至1500℃；升温速度范围0.1～100.00℃/min；TG测试量程0.5～1mg/min；DTA测试量程±1000μV（0.06）；DTG测试量程±200mg（0.2）；气体流量最大1000mL/min。

b.测定　两种待测样品经干燥、粉碎、研磨成一定粒度的粉末，放入Al2O3坩埚中，在N2保护下，采用Pyris Diamond TG/DTA型热重/差热综合热分析仪进行热重（TG）和差热（DTA）分析，测定出两种样品的TG-DTA工作曲线。

⑧红茂草提取物红外光谱检测

a.U值计算　不饱和度（U）：分子中距离达到饱和所缺一价元素的成对个数，每缺两个一价元素不饱和度为1个单位。若分子中只一、二、三、四价元素（主要指H、O、N、C等），则不饱和度有

U=（2+2n4+n3-n1）/2

式中，n1、n3、n4分别为分子式中的一、三、四价元素的数目。在计算不饱和度时，二价元素的数目无需考虑，因为它根据分子机构的不饱和情况以双键或单键来填补。

b.测试条件　光谱范围375～7800cm-1；分辨率0.2cm-1；信噪比35000∶1；波数精度0.01cm-1；吸收精度0.1%T；陶瓷光源。

c.测定　将两种样品分别做红外光谱分析。在玛瑙研体中放入2mg样品和300mg锭剂KBr，将两者研磨使其混合均匀，取混合物200mg置于锭剂成型器中加压制成薄片。将压片放入样品槽中，采用Spectrum One傅立叶红外光谱仪测量该样品的红外吸收光谱，测量波长为450～4000cm-1。

⑨红茂草提取物紫外光谱检测

a.测试条件　波长范围190～1100nm；波长精度±0.1nm；光度计精度<0.003A；重复性<0.001A；基线漂移<0.00015A/h；吸光度及透过率范围190～1100nm。

b.测定　将两种样品分别进行紫外光谱分析。在1cm×1cm石英比色管中加入事先配制好的溶液4mL（将2mg样品溶于40mL蒸馏水中），另取不含该样品的蒸馏水做为空白对照，采用Lambda 35型紫外可见光光度计，于波长为200～400nm范围内进行测定。

⑩红茂草提取物质谱检测

a.测试条件　相对分子质量范围15～800amu（相对原子质量单位）；相对分子质量精度0.2amu；色谱柱DB1701；弹性石英毛细管柱30mm×0.125mm id，0125μm；柱温60℃，保持1min；每分钟升温10℃升至260℃，保持30min；气化室温度230℃；溶剂延迟3min；传输线温度230℃；进样量0.1μL；载气He；载气流量3mL/min；分流比49.7/1；EI离子源；离子源温度230℃；电子能量70eV；质量扫描范围20～500amu。

b.测定　取2mg样品溶于40mL氯仿中，配制成溶液，取少量该溶液置于石英比色皿中，放入仪器内，通上载气，启动仪器及电脑，等待相关谱图出现。

5.5.2　结果与分析

（1）红茂草提取物化学成分预实验

采用在醇溶剂析出的结晶Ⅰ和石英色谱柱层析分离的结晶Ⅱ，这两种红茂草提取物，经过三种生物碱试剂检验，重复三次实验，发现两种红茂草提取物均呈明显的阳性反应，其实验结果如表5-20所示。

注： + 表示阳性。

化学成分预实验结果表明，从红茂草中提取的两种提取物均含有生物碱化学成分。

（2）红茂草提取物TLC检测

本实验通过先后配制的25种展开剂，对红茂草原液进行了TLC检测，以期寻找到一种展开效果最为理想的试剂。其实验结果如表5-21所示。

从不同展开剂的斑点颜色及比移值（Rf）来看，选用V95%乙醇∶V冰乙酸∶V水∶V浓氨水（15∶0.5∶2.5∶0.5）做为展开剂效果最佳。

以V95%乙醇∶V冰乙酸∶V水∶V浓氨水（15∶0.5∶2.5∶0.5）为展开剂，对红茂草原液与两种提取物进行TLC检测，在紫外灯照射下观察其色斑情况，并测定其Rf值。其实验结果如表5-22所示。

从红茂草原液的TLC检测结果看，有5种不同颜色的色斑，且显示色谱斑点清晰规则、专属性好，说明红茂草中至少含有5种生物碱（这与文献记载一致）。将分离得到的提取物Ⅱ做TLC检测，观察到有一个清晰色斑，结合比移值（Rf），说明初步分离提取的样品成分单一。提取物Ⅰ所显色斑不明显，不易观察，其成分尚有待进一步测定。

（3）红茂草提取物显微熔点测定

对红茂草两种提取物进行显微熔点测定，其测定结果如表5-23所示。

注：表中数据为3次重复实验的平均值。

实验结果表明红茂草提取物Ⅰ熔点387℃；提取物Ⅱ熔点395℃。但是不能简单应用显微镜熔点测定未知物的熔点，其测定结果只能做为进一步实验的数据参考。

熔点是晶体物质的重要物理特性，是对固体有机化合物纯度进行判定的基本手段之一。唯有晶体才有熔点，影响化合物熔点的因素很多，一般相对分子质量越大，熔点越高，而原料中的杂质、反应中添加的催化剂、增塑剂等助剂，还有副反应中生成的杂质等，均可使熔点降低。同时，分子的刚柔性、分子间力、共聚的情况、外力等也会改变熔点高低。生物碱的熔点即是分解点，指在熔融时同时分解，以生物碱结晶体突然融化时的温度作为熔点。

本实验不但测定了红茂草两种提取物的熔点，为其他实验提供了依据，而且从侧面也证实该提取物确为晶体。

（4）红茂草提取物元素测定

将两种红茂草提取物进行元素分析测定，得知该提取物中主要含有N、C、H三种元素，其测定结果如表5-24、表5-25所示。

从表中数据可知红茂草提取物Ⅰ中所含N元素最多，C、H两种元素最少。

从表中数据可以看出红茂草提取物Ⅱ中所含N元素亦最多，C元素次之、H元素最少，但红茂草提取物Ⅱ比Ⅰ的N、C、H三种元素含量要高。测定两种红茂草提取物的N、C、H元素的含量，可以为揭示该提取物的基本元素组成及组分含量，为进一步确定该提取物的结构奠定基础。

（5）红茂草提取物热重/差热综合测定的结果与分析

两种提取物均来自于绿色植物红茂草，由于其结构不同，热解温度不一样，会引起热重/差热工作曲线发生变化。图中的实线工作曲线（TG曲线）表示固体以气体或其他形式减少；虚线工作曲线（DTA曲线）其中出现的波谷代表吸热、波峰代表放热；点划线工作曲线表示TG和DTA曲线的微分曲线（一般不做研究）。两种红茂草提取物热重/差热综合测定结果如图5-17、图5-18所示。

由TG曲线看出，样品70～170℃加热时，发生了质量损失，约减少了3.5%，表征该样品有吸附水或结晶水脱失，并伴有热分解反应发生；从170～600℃之间，样品质量减少趋缓，在600℃时，质量约为90%，说明样品的热稳定性好，不易发生分解，在高温下仍稳定存在。由DTA曲线看出，样品在131.4～324.6℃时发生了两次吸热反应。

由TG曲线看出，样品在加热到60℃时，其质量起初缓慢减少，随着加热的进行，在温度接近80℃时，质量开始急速减少，说明开始时主要是除去了滞留在样品中的水分，随着温度的升高，样品开始分解，在到达140℃时，样品脱失约17.3%的吸附水或结晶水；从140～600℃时，质量减少趋缓，600℃时质量为69%，说明残留物的热稳定性较高。由DTA曲线看出，样品在79.8℃时发生了吸热反应，说明样品在热解反应的过程中，伴随有大量的热量吸收。

（6）红茂草提取物有机光谱检测的结果与分析

①红茂草提取物红外光谱检测的结果与分析

a.U值计算结果　在解析红外光谱前，对所求化合物的分子式计算不饱和度（U值），有助于推断未知物的结构。对红茂草5种主要成分进行U值计算，其结果如表5-26所示。

对于一个有机物化合物，当U≥4时，说明该提取物分子中可能含有苯环结构，为进一步进行红外光谱分析做好准备。

b.红外光谱检测的结果与分析　将两种红茂草提取物进行红外光谱检测，其测定结果如图5-19、图5-20所示。

由谱图可知，在3689.02～3588.15cm-1处是一系列尖锐、强度不定的吸收峰，这是—OH伸缩振动的结果；3467.29cm-1处的吸收峰说明有N—H存在；2926.11 cm-1、2852.25cm-1是饱和C—H键的特征吸收，可判断—CH3的存在；在1765.22cm-1、1736.86cm-1的吸收峰是CC—COOH或Ar—COOH的振动峰，说明该未知物有苯环结构存在；1384.51cm-1处有强吸收峰，是—CH3的弯曲振动；835.64cm-1处有较强吸收峰，是对位取代苯的特征峰。

由谱图可知，在1616.60cm-1的吸收峰是鉴别有无芳环存在的重要标志；3481.96cm-1、3413.64cm-1为胺基的反对称和对称伸缩振动吸收；2494.69cm-1、1777.46cm-1、1696.53cm-1、1637.34cm-1、1616.60cm-1是累积双键的伸缩振动区，在1637.34cm-1处是C=C伸缩振动吸收特征峰，更进一步证明了烯基结构的存在；1440.81cm-1是苯环的骨架振动峰，说明有苯环结构存在；酮类的主要特征峰CO在1715cm-1处，这是有无酮的重要依据，该提取物没有在此处出峰，说明该提取物中不含酮键；879.68cm-1为对位取代苯。

②红茂草提取物紫外光谱检测的结果与分析

将两种红茂草提取物进行紫外光谱检测，其测定结果如图5-21、图5-22所示。

由于助色团的影响，吸收带发生了红移，即在波长为300nm处有一个最大吸收峰，表示有B带吸收，说明该提取物中可能含有苯环结构或共轭基团（即1，3-二丁烯结构）；在280nm处有一个小的吸收峰，表示有R带吸收，说明该提取物中可能存在两种共轭基团，或者含有一些简单的非共轭并含有n电子的生色基团，如羰基等；在245nm处有强吸收峰，表示有K带吸收，说明该提取物可能是含有两个双键的共轭体系，如共轭二烯或α，β-不饱和酮等。

在紫外光谱图中可以看到，该提取物在约205nm处有一个最大吸收峰，表示有K带吸收，说明该提取物可能是含有两个双键的共轭体系，如共轭二烯或α，β-不饱和酮等。

③红茂草提取物质谱检测的结果与分析

质谱检测是在高真空系统中测定样品的分子、离子及碎片离子质量，以确定样品相对分子质量及分子结构的方法。质谱图以质荷比（m/z）为横坐标，以离子峰的相对丰度（%）为纵坐标。将两种红茂草提取物进行质谱检测，其结果如图5-23～图5-28所示。

红茂草提取物Ⅰ共出6张谱图，综合各谱图可以得到以下结构信息：m/z17是醇ROH的分子离子峰；m/z18是醇、醛、酮、胺等的分子离子峰；m/z28是环烷烃、烯烃、芳烃、醚等的分子离子峰；m/z32是甲酯、-OH的分子离子峰；m/z43是环酰胺的分子离子峰；40、70、77（m/z）是芳香化合物的分子离子峰；m/z55是Ar-O-、烯基、烷基等的分子离子峰；m/z57是乙基酮、高度分支碳链的分子离子峰（图5-29）。

从红茂草提取物Ⅱ谱图可知：碎片离子的质荷比大多数为奇数，根据氮规则可推测该提取物可能为含奇数氮化合物；m/z29是高度分支的碳链、在分支处乙基裂解、环烷烃等的分子离子峰；m/z43是烷基，且分子离子经α断裂的产物，特征性不同；m/z45是CH3O-或-OH的特征峰；m/z59是醚键；v91是芳基的特征峰；谱图中基峰m/z99、强峰m/z73是化合物碎裂时失去部分甲基产生的。

5.5.3　结论

a.本实验采用石英色谱柱层析，以（200～300目）中性Al2O3干法装柱。由于红茂草生物碱极性较大，故选用极性溶剂氯仿进行洗脱，效果较理想。用该法只分离出一种单一组分（经TLC检测），其他单体尚未找到分离和提取的有效方法，仍有待于以后的实验去解决。通过该实验也说明此法在中草药生物碱的分离和提取中，有很好的应用前景。从红茂草95%乙醇浸泡液中析出的棱柱状白色结晶，可能是由于温度关系，有部分生物碱因为凝固点较低而析出。

b.采用TLC检测可以大致确定红茂草生物碱的种类及其组分，其所用的展开剂是实验成败的关键。由于红茂草生物碱极性较大，在实验过程中一般选用强极性溶剂，加入少量的吡啶、冰乙酸、浓氨水，主要是防止色斑产生扩散和拖尾现象，使色斑呈规则圆形。本实验通过几十种不同展开剂的配比使用，进行比较发现：以V95%乙醇∶V冰乙酸∶V水∶V浓氨水（15∶0.5∶2.5∶0.5）做为展开剂，是目前实验阶段，TLC检测红茂草生物碱的最好配比。

c.对红茂草生物碱进行显微镜熔点测定、元素分析等，是基于物理化学方法对未知物性质的研究。热重分析（TG）是材料学研究中测定物质加热（或冷却）时伴随其物理、化学变化的同时所产生热效应的一种方法。用于热重法的仪器是热天平，它能连续记录质量与温度的函数关系曲线，将质量对时间求导则得出微商热重曲线。热重分析通常与差热分析结合在一起使用，在同一次测量中可同步得到热重与差热信息。差热分析（DTA）是在程序控制温度下，试样与参比物一起在测量温度范围内不发生任何热效应的物质之间的温度差与温度关系的一种技术。在实验过程中，可将试样与参比样之间的温差作为温度或时间的函数关系连续记录下来，温差为纵坐标，温度为横坐标的差热曲线向上或向下的峰反映了试样放热和吸热过程，峰的形状、位置与相应的温度可用来定性的鉴定研究对象峰的面积比例与热量变化，可用来半定量或某些情况下定量的测定反应热。热重/差热综合分析是材料热分析方法中最简便易行、也是应用最广泛的方法之一。以上方法可初步测定未知物的相关物理指标及化学性质，为其他化学光谱检测提供相关数据。

d.紫外光谱是由于分子中价电子或外层电子发生跃迁产生的。分子中价电子能级跃迁的同时，伴随着振动能级和旋转能级的跃迁。紫外光谱通常不是尖锐的吸收峰，而是一些平滑的峰包。鉴定化合物时主要根据光谱图上的一些特征吸收，特别是最大吸收波长λmax和摩尔消光系数ε值，来进行鉴定。该测定方法主要应用于推导有机化合物的分子骨架中是否含有共轭结构体系，该有机化合物共轭发色基团的鉴定、成分分析、互变异构体测定、不饱和化合物的结构骨架确定等，但是很多化合物在紫外没有吸收或者只有微弱的吸收，并且紫外光谱一般比较简单，特征性不强，所以其只能用来检验一些具有大的共轭体系或发光官能团的化合物，单独使用紫外光谱进行有机化合物结构分析是比较困难的。紫外光谱只有与其他物理、化学资料以及其他光谱方法相结合，才能发挥较大的作用。应用紫外光谱测定红茂草生物碱，可以确定其主要结构骨架和特征官能团的结构，做为初步鉴定的依据。

e.红外光谱测定未知物时，主要是通过指纹区吸收的峰形和峰强度来判断该物质的结构。该法可应用于化合物分子结构的测定、未知物鉴定以及混合物成分分析。根据光谱中吸收峰的位置和性状可以推断未知物的化学结构；根据特征吸收峰的强度可以测定混合物中各组分的含量；应用红外光谱可以测定分子的键长、键角，从而推断分子的立体构型，判断化学键的强弱等。但是由于化合物的红外光谱往往十分复杂，影响红外光谱吸收峰数目、频率、强度及形状的因素很多，使红外光谱的解析更带有经验性。通过对红茂草生物碱进行的红外光谱测定，可以比较清楚地观察到其主要结构及官能团的类型，更进一步确定其分子结构。

f.质谱分析最主要的目的是取得被测物的相对分子质量信息，根据分子离子峰和附近碎片离子峰的m/z差值推测被测物的类别及结构；根据碎片离子的质量及所符合的化学通式，推测离子可能对应的特征结构片断或官能团。通过对红茂草生物碱的质谱分析，可以更进一步确定其主要官能团及碎片离子，为准确确定其分子结构奠定了基础。

g.紫外光谱仅可判断分子中有无共轭结构，红外光谱只能判断分子中含有何种官能团，要准确判断分子结构，仅靠这两种和质谱是不够的，但由于实验条件及其他原因，对红茂草生物碱化学成分的分析及测定只进行到此。当对一种结构比较复杂的未知物进行鉴定，仅凭一种或几种谱图是难以准确判定其分子结构的，还需要借助于气-质联用谱、核磁共振谱、高效液相色谱、液相色谱-质谱联用等技术，同时还需要把多种波谱技术进行综合分析，互相印证，才能得出正确的结论。对于红茂草生物碱化学成分的分析还需做进一步的研究，以期最终得到完整准确的分子结构。