5.6 RP-HPLC法测定异紫堇碱的含量和相关物质
异紫堇碱音译名异可利定，为阿朴啡类生物碱，具有较好的药理学活性，如抗心律失常、舒张血管、抗缺氧作用等。2010年，国家食品药品监督管理局批准异紫堇碱盐酸盐（盐酸异可利定片）作为处方药（批准文号国药准宇H53021977）用于胃、肠、胆、胰、子宫、血管痉挛所致的疼痛，属解痉镇痛药。最近的研究显示异紫堇碱可以通过诱导PDCD4相关细胞凋亡，选择性作用于耐药的肝癌干细胞，也可以通过选择性G2/M细胞周期抑制和诱导细胞凋亡而抑制肝癌细胞分化，由此可见异紫堇碱作为解痉镇痛药或抗癌药物及其先导物，均具有一定的开发应用前景。
异紫堇碱在紫金龙和白线薯等植物中有比较丰富的分布，本研究在对西北特色植物红茂草的化学成分研究中发现，异紫堇碱在该植物中的含量较高，为了开发利用西北区域丰富的植物资源，红茂草可以作为异紫堇碱的植物资源加以利用。木文采用高效液相色谱法，测定异紫堇碱的含量和进行有关物质的检查。该法简便、快速，结果准确、可靠，可以更好地控制木品的质量，为异紫堇碱及红茂草的有效利用提供科学依据。
5.6.1 材料与方法
（1）材料
①仪器
Agilent 1200型组合式全自动高效液相色谱仪，包括Agilent G1315B DAD检测器、G1328B手动进样器及配套的Agilent Chemstation for LC 3D化学工作站（version A.10.02）；电子分析大平为Sartoirus BT 2245型。
②试药
异紫堇碱对照品为木实验室分离纯化，经NMR，HR-ESI-MS，X-Ray等光谱波谱技术鉴定为木品，纯度为98.6%；异紫堇碱样品为木实验室采用大孔吸附树脂技术自制产品（批号20121001、20121015、20121020、20121103、20121115、20121125），乙腈为色谱纯；磷酸、三乙胺为分析纯；实验用水为一次蒸馏水。
（2）方法
①色谱条件
色谱柱SinoCrom ODS-BP C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相（体积比，以下略）乙腈-0.2%磷酸（50∶50，三乙胺调pH至6.02）；检测波长270nm；流速1.0mL/min，柱温30℃；进样体积20μL。在上述条件下，异紫堇碱对照品溶液和供试品溶液高效液相色谱图如图5-30所示。
图5-30 对照品溶液（A）和供试品溶液（B，批号20121L15）高效液相色谱
②溶液的配制
a.对照品储备液 取异紫堇碱对照品约15mg精密称定，置于5mL量瓶中，加流动相使其溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
b.对照品溶液 精密吸取对照品储备液200μL置5mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
c.供试品储备液 取批号20121115异紫堇碱样品约15mg精密称定，置于5mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
d.供试品溶液 精密吸取供试品储备液200μL置5mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
5.6.2 结果与分析
（1）专属性实验
将供试品储备液加流动相稀释至约60μg/mL。分别以0.1mol/L盐酸溶液、3mol/L氢氧化钠溶液和30%过氧化氢溶液为强破坏条件，进行酸破坏、碱破坏和氧化破坏实验。另取2份分别放进90℃的水浴（2h）和在254nm紫外灯照射（1h），进行热破坏和紫外线破坏实验。
将上述破坏后的供试品溶液照前述的色谱条件进行降解产物检出实验（图5-31）。结果表明，经酸、热和紫外条件破坏的供试品溶液的色谱图均有不同程度的杂质峰产生，特别是在酸条件下和紫外破坏条件。但是在碱和氧化条件下，供试品溶液相对比较稳定。
图5-31 HPLC方法专属性考察图谱
A—酸破坏；B—碱破坏；C—热破坏；D—紫外线破坏；E—氧化破坏；1—降解产物；2—异紫革碱
（2）线性范围
精密吸取对照品储备液适量，分别用流动相稀释得浓度为30μg/mL、60μg/mL、120μg/mL、180μg/mL、240μg/mL、300μg/mL的系列溶液，分别取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图。以异紫堇碱峰面积Y为纵坐标，对照品溶液浓度X为横坐标，进行线性回归处理，得回归方程：
Y=41.13X-330.3（R2=0.9999）
结果表明异紫堇碱浓度在30～300μg/mL范围内线性关系良好。
取上述对照品溶液适量，加流动相逐级稀释后依法测定，以10倍噪音（S/N=10）和3倍噪音（S/N=3）计算最低定量限和检出限分别为0.03ng和0.0075ng。
（3）精密度实验
取前述对照品储备液加流动相稀释至60μg/mL，精密吸取20μL，连续进样5次，峰面积RSD（n=5）为1.6%，本方法精密度良好。
（4）稳定性实验
取同一份供试品溶液，用流动相稀释至约100μg/mL，在上述相同色谱条件下，分别于室温放置0、2h、4h、6h、8h、10h、24h后进样测定，计算得异紫堇碱峰面积的RSD为2.7%（n=7）。表明供试品溶液在室温下24h内稳定。
（5）重复性实验
取20121115批号样品，按照前述方法分别制备5份供试品溶液，测定异紫堇碱含量为96.9%，RSD为0.02%（n=5），说明方法重复性良好。
（6）回收率实验
取20121115批号样品约15mg，精密称定，称取5份，分置s mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。精密吸取此溶液200μg，置s mL量瓶中，再精密加入对照品溶液20μg，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取20μg，进样测定，结果如表5-27所示。
表5-27 回收率实验结果（n=5）
（7）耐用性实验
①流动相pH变化
将流动相pH分别调为5.75、6.02、6.25，取同一份供试品溶液，精密吸取（20μg/L），进样测定，记录峰面积，计算异紫堇碱峰面积的RSD（n=6）为2.8%。
②流动相比例变化
将流动相乙腈-三乙胺比例分别调为48∶52、50∶50、52∶48，取同一份供试品溶液，精密吸取20μg，进样测定，记录峰面积，计算异紫堇碱峰面积的RSD（n=6）为0.75%。
③柱温变化
将柱温分别调为25℃、30℃、35℃，取同一份供试品溶液，精密吸取（20μg），进样测定，计算异紫堇碱峰面积的RSD（n=6）为1.5%。
④检测波长变化
将检测波长分别调为265nm、270nm、275nm，取同一份供试品溶液，精密吸取20μg，进样测定，记录峰山面积，计算异紫堇碱峰山面积的RSD（n=6）为2.6%。
（8）含量测定
精密吸取前述方法制备的供试品溶液及对照品溶液，用流动相稀释至线性范围后，精密吸取20μg，按上述色谱条件进行分析，按外标法以峰面积计算异紫堇碱的含量，6批样品的含量结果如表5-28所示。
表5-28 不同批次样品异紫堇碱的含量测定结果
5.6.3 结论
根据上述含量测定和有关物质检查方法，对样品进行二极管阵列检测，由DAD光谱图可知，木品和专属性实验产生的降解物质在270nm处有最大吸收，故选择270nm作为检测波长。
以0.2%磷酸水溶液（用三乙胺调节pH）-乙腈（50∶50）为流动相，考察其pH对异紫堇碱色谱行为的影响。结果表明，pH对主峰与相邻杂质峰间的分离度、保留时间、对称性均有影响。流动相的pH越高，异紫堇碱在色谱中的保留时间越长。而pH为6.02时主峰与相邻杂质峰间的分离度、保留时间、拖尾因子均较好，因此确定流动相的最佳pH为6.02。
上述流动相的其他条件不变，改变流动相中乙腈的浓度，考察异紫堇碱的色谱行为变化。实验结果表明，乙腈浓度对异紫堇碱主峰与相邻杂质峰间的分离度、保留时间均有显著的影响。随着乙腈浓度的增加，主峰与相邻的杂质峰间的分离度减小，保留时间缩短，当乙腈浓度为50%时，保留时间在8min左右，能满足含量测定的快速要求。乙腈浓度对主峰对称性影响较小。因此，确定流动相中乙腈浓度为50%。
在实验过程中发现，本品对紫外线和高温敏感，故实验操作应尽最避免强光照射及高温环境。