5.3 钼酸钠检测法测定红茂草胶囊中生物碱的含量
5.3.1 材料与方法
（1）材料
①仪器与试剂
TGL-20型台式高速冷冻离心机（长沙湘仪离心仪器有限公司）、UV-9200型紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）、UV-2450型紫外-可见分光光度计（日本岛津）、AUY-220分析天平（日本岛津）。
钼酸钠、浓硫酸、异紫堇碱标准品（购自ABCR Gmbh & Co.KG im Schlehert公司，批号166401，规格10mg）、三重蒸馏水等。
1%钼酸钠-浓硫酸试剂 取10mL浓H2SO4在不断搅拌下注入90mL水中，加入1g钼酸钠溶解后备用。
②样品
红茂草水提喷雾粉末（来自于本生物工程实验室）、红茂草胶囊（来自于由天水市某医院药剂科）。
（2）方法
要建立一种新的检测红茂草胶囊中生物碱含量的方法，首先对其所需的试剂，反应条件即时间，温度，试剂用量要进行优化选择。实验以红茂草生物碱和试剂反应后通过紫外吸收法测得的OD值的大小为考察指标，对其进行单因素和正交实验研究。考察各因素的影响效果及适宜范围，确定最佳反应条件。
①单因素实验
指示剂量180μL、225μL、270μL、315μL、360μL、405μL、450μL；水浴温度：50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃；水浴时间0min、5min、10min、15min、20min、25min、30min。
②正交实验
在单因素的基础上，建立L9（33）正交表，以水浴时间（A）、1%钼酸钠-浓硫酸量（B）、水浴温度（C）为影响因素（如表5-6所示）进行正交实验，优化最佳实验参数。
表5-6 红茂草生物碱正交实验
③最大吸收光谱波长的选择
准确称取红茂草生物碱标准品20mg溶于20mL的蒸馏水中，配制成1mg/mL的生物碱溶液，以3000r/min离心10min，取上清液备用。按表5-7所示，分别向每支试管中加入各种试剂后，振荡混匀，在70℃条件下水浴20min，使反应完全。
表5-7 红茂草生物碱标准品与显色试剂的反应
以1号管为空白对照，将2号管在UV2450型紫外-可见光光度计上于190～500nm波长范围内扫描，确定红茂草生物碱标准品中总生物碱的最大吸收波长。以3号管在为空白对照，将4号管在UV2450型紫外-可见光光度计上于190～500nm波长范围内扫描，确定红茂草生物碱显色反应生成的浅蓝色物质的最大吸收波长。以1∶9稀硫酸为空白对照，将钼酸钠-浓硫酸试剂在UV2450型紫外-可见光光度计上于190～500nm波长范围内扫描，确定钼酸钠-浓硫酸试剂的最大吸收波长。
④用紫外吸收法测定样品胶囊生物碱量
a.标准曲线的绘制 准确称取红茂草生物碱标准品50mg溶于50mL的蒸馏水中中，配制成1mg/mL的标准生物碱溶液，以3000r/min离心10min，取上清液备用。按表5-8分别向每支试管中加入各种试剂后，振荡混匀，在70℃条件下水浴20min，再选用光程为1cm的石英比色皿，用1号管调零点，在310nm波长处分别测定各管溶液的光密度值。以质量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
表5-8 测定红茂草标准品的标准曲线
b.红茂草胶囊样品含量测定 准确称取样品50mg溶于50mL的蒸馏水中中，配制成1mg/mL的样品溶液，按上述方法处理样品。在1～5号试管内，分别加入5mL生物碱液，测定样品吸光度，对照标准曲线，得出样品中生物碱质量（mg）。
5.3.2 结果与分析
（1）单因素实验
①指示剂量对反应结果的影响
由图5-9可知随着指示剂用量的增加，OD值也随着不断增大，当达到360μL时，OD值最大，后来值开始下降，综合考虑指示剂消耗和成本，所以指示剂量选择360μL。
图5-9 指示剂的量对反应结果的影响
②水浴温度对反应结果的影响
由图5-10可知在一定范围内，随温度的升高，OD值也不断，当水浴温度为70℃时，OD值最大，后来OD值缓慢下降，故水浴温度选择70℃。
图5-10 水浴温度对反应结果的影响
③水浴时间对反应结果的影响
由图5-11可知OD值随着反应时间的增加而增大，但当超过20min后，OD值开始缓慢下降，从节省时间角度考虑，水浴时间选用20min比较合适。
图5-11 水浴时间对反应结果的影响
（2）正交实验
按正交实验设计，测定不同条件下红茂草生物碱反应后的颜色，透明度的变化情况，重复三次取平均值，从而确定红茂草中生物碱的最佳检测方案，其结果如表5-9、表5-10所示。
表5-9 红茂草生物碱正交实验结果
表5-10 红茂草生物碱正交实验方差分析表
①表示显著；②表示极显著。
（3）最大吸收光谱波长的选择
UV扫描光谱显示，红茂草生物碱标准品在196～210nm波长处具有最大吸收值（图5-12）。
图5-12 红茂草生物碱标准品的最大吸收光谱波长
UV扫描光谱显示，红茂草生物碱显色反应生成的浅蓝色物质在310nm波长处具有最大吸收值（图5-13）。
图5-13 红茂草生物碱显色反应生成的浅蓝色物质的最大吸收光谱波长
UV扫描光谱显示，1%钼酸钠-浓硫酸试剂在218nm波长处具有最大吸收值（图5-14）。
图5-14 1%钼酸钠-浓硫酸试剂最大吸收光谱波长
由上各图可知，红茂草生物碱标准品在196nm波长处有最大吸收值，1%钼酸钠-浓硫酸试剂在218nm波长处具有最大吸收值，红茂草生物碱显色反应生成的浅蓝色物质在310nm波长处具有最大吸收值，三者之间的差异较大，故可以通过采用紫外吸收法建立红茂草胶囊中生物碱量的测定方法。
（4）用紫外吸收法测定样品胶囊生物碱量
①标准曲线的绘制
由图5-15可知，Y=0.1281X+0.0165（R2=0.9992），接近于1，说明其吸光度与生物碱浓度呈良好的线性关系。
图5-15 红茂草生物碱标准品标准曲线
②红茂草胶囊样品含量测定
见表5-11、表5-12。
表5-11 天水市某医院红茂草胶囊质量
表5-12 红茂草胶囊样品含量测定
计算1～5号样品中的生物碱含量：
1号质量分数=9.346mg/50mg=18.690%
2号质量分数=9.350mg/50mg=18.700%
3号质量分数=9.360mg/50mg=18.720%
4号质量分数=9.365mg/50mg=18.730%
5号质量分数=9.340mg/50mg=18.680%
③检测实验
通过配置1mg/mL异紫堇碱的标品溶液，按如上方法操作，测得OD值为0.1240，带入Y=0.1281X+0.0165得X=0.493mg，其值略小于0.50mg，结果说明其方法可行。
5.3.3 结论
有些生物碱能和某些试剂反应生成特殊的颜色，叫做显色反应，常用于鉴识某种生物碱，常用的显色剂有矾酸铵-浓硫酸溶液（Mandelin试剂）、钼酸铵-浓硫酸溶液（Frohde试剂）、甲醛-浓硫酸试剂（Marquis试剂）浓硫酸和浓硝酸等，钼酸铵-浓硫酸溶液为1%钼酸钠或钼酸铵的浓硫酸溶液，它遇乌头碱显黄棕色，小檗碱显棕绿色，阿托品不显色。本实验采用红茂草生物碱液与1%钼酸钠-浓硫酸的显色反应来研究并确立红茂草中生物碱含量的检测方法。红茂草生物碱1mg/mL与360μL 1%钼酸钠-浓硫酸试剂在70℃水浴20min，生成浅蓝色物质，通过紫外-分光光度计检测浅蓝色物质最大吸收峰为310nm，并用1mg/mL异紫堇碱标准品对此方法进行验证，得检测值0.493mg略小于实际值0.50mg，以此建立有一种检测红茂草生物碱含量的新方法，用建立的检测方法对甘肃省天水市某医院生产的红茂草胶囊中生物碱的含量检测，结果表明生物碱平均含量在18.65%～18.75%之间。
虽然目前国内对红茂草药物进行了大量的研究，但对红茂草生物碱的显色反应及对应用于临床药品中生物碱含量测定的研究报道却很少，此方法的建立对于红茂草在医药领域的应用提供了一定的理论依据。显色反应受生物碱纯度的影响很大，生物碱愈纯，颜色愈明显。由于红茂草中所含的生物碱种类比较多，生物碱液与1%钼酸钠-浓硫酸反应生成的蓝色物质，还未精确到某一确定的生物碱，本实验只是选取异紫堇碱作为一种测定指标，后续实验还需做进一步研究。影响红茂草生物碱与1%钼酸钠-浓硫酸反应的因素很多，本实验仅对影响其反应的相关因子温度、时间、1%钼酸钠-浓硫酸用量进行了研究，但诸如pH等其他因素对本实验反应的影响还需今后做进一步明确。