5.2 酸性染料比色法测定红茂草中总生物碱的含量
5.2.1 材料与方法
（1）材料
UV-751GD型紫外-可见光分光光度计（上海分析仪器厂）、RE52-99型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、AB104-S型精密电子分析天平（瑞士梅特勤公司）、SH8-Ⅲ型循环水式多用真空泵、索氏提取器、pH计等。
红茂草采自甘肃林区，由青海大学张英博士鉴定，经自然风干、粉碎过80目筛。异紫堇碱标准品（购自ABCR Gmbh & Co.KG im Schlehert公司，批号166401，规格10mg）、溴甲酚绿、枸橼酸、磷酸氢二钠、氯仿，其余试剂均为国产或进口分析纯。
（2）方法
①不同浓度缓冲液的配制
准确称取枸橼酸5.0g加水溶解至250mL为A液，磷酸氢二钠18.0g加水溶解至250mL为B液，分别取A、B液61.0mL和39.0mL，混匀，调pH=4.0。另取四组A液各61.0mL，四组B液各39.0mL，将A、B试液混合，得四组混合液，再分别向其中滴加枸橼酸或磷酸氢二钠，至四份混合液的pH分别为3.5、4.5、5.0、5.5，待用。
②溴甲酚绿溶液的配制
准确称取溴甲酚绿0.1g加pH=4.0枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液溶解至100mL，摇匀静置。同法配制pH为3.5、4.5、5.0、5.5的溴甲酚绿缓冲液，待用。
③供试品溶液的制备
取红茂草干燥粉末10.0g置于索氏提取器中，加入150mL 65%的乙醇回流1h，抽滤。同法提取两次，合并滤液，转入旋转蒸发仪中，40℃减压浓缩2h，然后于50mL容量瓶中定容，即得供试品溶液。
④测定波长的选择
准确吸取0.5mL供试品溶液，加入pH=4.0的枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲溶液至2.0mL。加入1.5mL溴甲酚绿溶液、10.0mL氯仿，振摇3min，静置0.5h，用分液漏斗分取氯仿液待测；另取2.0mL枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，加入1.5mL溴甲酚绿溶液、10.0mL氯仿，振摇3min，静置30min，用分液漏斗分取氯仿液作参比液。将得到的两组氯仿液分别转入到两个玻璃比色皿中，用紫外-可见分光光度计在不同波长下测其吸光度。
⑤缓冲溶液pH的选择
用移液管准确量取0.5mL稀释后的供试品溶液，加pH=3.5的枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液溶至2.0mL，再加10.0mL氯仿。振摇3min，静置30min，用分液漏斗分取氯仿层待测。用移液管准确量取pH=3.5的枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液溶2.0mL，准确加入1.5mL溴甲酚绿溶液和10.0mL氯仿，振摇3min，静置30min，用分液漏斗分取氯仿层作参比。将得到的氯仿层溶液分别转到比色皿中，并在415nm波长下利用紫外-可见分光光度计测吸光度。同法测pH=4.0、4.5、5.0、5.5时的吸光度。
⑥酸性染料用量的选择
准确吸取1.0mL稀释后的供试品溶液，加入1.0mL溴甲酚绿溶液，pH=4.0的枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲溶液1.0mL、10.0mL氯仿，振摇3min，静置30min，分取氯仿液待测。另取pH=4.0的枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液溶2.0mL，加入1.0mL溴甲酚绿溶液、10.0mL氯仿，振摇3min，静置30min，分取氯仿液作参比。将氯仿液转至比色皿中，在415nm波长下测其吸光度。同法测酸性染料量为1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL时的吸光度。
⑦标准曲线的绘制
准确量取配置的异紫堇碱标准品溶液1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL，按1.2.4项测定方法进行测定，在415nm处测其吸光度，以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
⑧稳定性实验
取异紫堇碱标准溶液2.0mL，按标准曲线测定方法，每隔1h测定其吸光度，观察吸光度随时间的变化情况。
⑨精密度实验
取异紫堇碱标准溶液2.0mL，按标准曲线测定方法，制备标准品供试液和空白对照液，在415nm波长处测定，重复测定5次。
⑩样品含量的测定
样品供试液三份各0.5mL，按1.2.4项测定方法进行测定，在415nm处测其吸光度，根据标准曲线计算红茂草中总生物碱的含量。
5.2.2 结果与分析
（1）波长的选择
供试液波长的选择结果，如图5-7所示。
图5-7 不同波长下供试液的吸光度曲线
可知在415nm波长处，稀释后的供试液有最大吸光度，因此选择该处为测定的最适波长。
（2）比色条件的选择
变化缓冲溶液pH值和酸性染料用量，得出最佳适用条件，其结果如表5-4所示。
表5-4 比色条件选择的结果
可知在pH=4.0的酸性条件下，稀释后的供试液有最大吸光度；当酸性染料溴甲酚绿溶液加入量为1.5mL时，吸光度最大。
（3）标准曲线的绘制
根据样品含量测定的结果，得回归方程：Y=0.0320X-0.0330，R2=0.9997，如图5-8所示。
图5-8 异紫堇碱标准曲线
（4）稳定性实验
稳定性实验结果表明，待测液在5h内稳定，其RSD=0.045%（n=5）。
（5）精密度实验
精密度实验结果表明，重复测定5次。结果RSD=0.530%（n=5）。
（6）样品含量的测定
根据标准曲线计算红茂草中总生物碱的含量，其结果如表5-5所示。
表5-5 红茂草总生物碱含量的测定结果
表明异紫堇碱标准品在21.60～54.00mg/mL范围内具有良好的线性关系，酸性染料比色法测定的红茂草总生物碱含量为1.386%。
5.2.3 结论
酸性染料比色法是在一定的pH条件下，红茂草中生物碱类（B）可与氢离子结合成盐（BH+），酸性染料溴甲酚绿解离成阴离子（In-）。阴阳离子结合成有色离子对化合物（BH+·In-），可以定量的被有机溶剂（如氯仿）提取，在一定波长下测定该有色溶液的吸光度，可计算出生物碱的含量。本实验以异紫堇碱为标准品，分别在波长为415nm、pH=4.0的枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲溶液、1.5mL 0.1%溴甲酚绿染色剂作用下，测定出红茂草生物碱的最大吸光度，并计算出其生物碱含量为1.386%。该法快速、准确、简便，可以适用于红茂草中总生物碱含量的测定。