第三节　小鼠神经干细胞培养

一、成年鼠神经干细胞培养

神经干细胞具有自我更新和分化成中枢神经系统不同类型细胞的能力。体外分离培养和分析神经干细胞是揭秘神经发生的细胞和分子机制的重要方法，也有助于神经系统疾病和神经损伤干细胞治疗的条件优化。成年哺乳动物脑内神经发生主要集中在两个区域：侧脑室室下区（subventricular zone of the lateral ventricle，SVZ）和海马齿状回的颗粒下层（subgranular zone of the dentate gyrus in the hippocampus，SGZ）。SGZ区的神经干细胞主要产生海马齿状回兴奋性谷氨酸能神经元。SVZ区的神经干细胞产生抑制性的γ-氨基丁酸能神经元和嗅球的多巴胺能中间神经元。除了分化为不同的神经元外，这两个区域的神经干细胞对神经营养因子、神经生理和病理刺激的反应性也不同，然而，这两个区域神经干细胞具有不同特性的分子机制并不十分清楚。因此，比较同一个脑组织中，这两个神经发生区域神经干细胞的特征显得尤为重要。

近些年来，国际上相关领域的专家一直都在优化成年鼠神经干细胞的分离培养条件，但仍然存在很多的不足之处，如贴壁单层生长的细胞容易分化、所需的鼠脑数量较多等。本文将介绍一种从一只鼠脑中同时分离培养DG区和SVZ区神经干细胞的方法。

1.材料

8～12周雌性或雄性C57BL/6J小鼠、Hank′s平衡盐溶液（HBSS，购自Invitrogen，货号14025-126）、Neurobasal 培养基（购自Invitrogen，货号21103-049）、DMEM/F12培养基（购自Invitrogen，货号11330-032）、B27添加物（购自Invitrogen，货号17504-044），N2 添加物（购自Invitrogen，货号17502-408，无菌分装）、GlutaMAX（购自Invitrogen，货号35050-038，无菌分装）、L-谷氨酰胺（购自Invitrogen，货号2503-081，无菌分装）、青霉素/链霉素溶液（Antibiotic-Antimycotic，购自Invitrogen，货号15240-062，无菌分装）、碱性纤维生长因子（bFGF-2，购自PeproTech，货号100-18B-B）、表皮生长因子（EGF，购自PeproTech，货号100-15）、MACS神经组织分离试剂盒（购自Miltenyi Biotec，货号130-092-628）、β-巯基乙醇（购自EM Sciences，货号MX031OMB-1，属剧毒品，在通风橱中打开）、Percoll分层液（购自Amersham Biosciences，货号17-0891-01）、10×DPBS（购自Invitrogen，货号14200-059）、1× DPBS（购自Invitrogen，货号14190-136）、多聚鸟氨酸（Poly-L-ornithine，购自Sigma-Aldrich，货号P-3655）、层粘连蛋白（Laminin，购自BD Biosciences，货号354232）、维甲酸（Retinoic acid，RA，购自Sigma-Aldrich，货号R2625）、毛喉素（Forskolin，FSK，购自Sigma-Aldrich，货号F6886）、二甲亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO，购自Sigma-Aldrich，货号D2650），超纯水（Mini Q）、75%酒精、4%多聚甲醛、细胞消化液（购自Accutase）、磷酸盐缓冲液（PBS）、5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-deoxy Uridine，Brdu）。

2.仪器

6cm和10cm直径的细胞培养皿，离心管，1ml带滤芯的吸头，超低黏附6孔和24孔细胞培养板；解剖工具［眼科剪（购自Roboz，货号RS-5840、RS-6942），眼科镊（购自Roboz，货号RS-5237、RS-5095）］；解剖显微镜；McⅡwain 组织切片机（购自The Mickle Laboratory Engineering Co.LTD，货号10180）及刀片；MACSmix 离心管混匀器（购自Miltenyi Biotec，货号130-090-753）；无菌试纸（购自Fisher Scientific，货号14-959-92B）；低速离心机（购自Eppendorf，型号5702，货号022626001）；数字相差倒置显微镜（购自Olympus，CK41）。

3.试剂准备

（1）碱性纤维生长因子和表皮生长因子：按照说明书将母液配制成0.1mg/ml浓度，50ml分装后-80℃保存，使用前用Neurobasal培养基稀释成终浓度10μg/ml，4℃保存不超过2周。

（2）溶液A：1× Hank′s平衡盐溶液中含有30mmol/L的葡萄糖，2mmol/L的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，26mmol/L的碳酸氢钠，无菌过滤后4℃保存不超过4周。

（3）起始增殖培养基（initial proliferation medium，IPM）：48ml Neurobasal培养基+1ml B27添加物+0.5ml GlutaMAX+0.5ml青霉素/链霉素溶液（100×）+20ng/ml碱性纤维生长因子+20ng/ml表皮生长因子，4℃保存不超过2周。

（4）N2培养基：500ml DMEM/F12培养基+5ml N2添加物+5ml L-谷氨酰胺+5ml青霉素/链霉素溶液（100×）。使用N2培养基传代神经干细胞以前，添加终浓度为20ng/ml碱性纤维生长因子和20ng/ml表皮生长因子，4℃保存不超过4周。

（5）β-巯基乙醇的稀释：34.7ml β-巯基乙醇+10ml无菌双蒸水，每次新鲜配制。

（6）消化酶混合物1：将MACS神经组织分离试剂盒中的2ml溶液2+50ml溶液1+2.5ml稀释后的β-巯基乙醇混匀。若用两只8～12周雌性或雄性C57BL/6J小鼠，则溶液的量相应增加。

（7）消化酶混合物2：将MACS神经组织分离试剂盒中的溶液3+10ml 溶液4混匀。若为两只8～12周雌性或雄性C57BL/6J小鼠，则溶液的量相应增加。

（8）Percoll分层液：倘若分离两只或两只以上的8～12周雌性或雄性C57BL/6J小鼠，才需要使用Percoll分层液，22.5ml Percoll分层液+2.5ml 10×DPBS，4℃保存不超过4周。

（9）维甲酸的配制：使用二甲亚砜（DMSO）将维甲酸配制成10mmol/L的母液浓度，-20℃分装，使用前1∶10000稀释。

（10）毛喉素的配制：使用二甲亚砜（DMSO）将毛喉素配制成10mmol/L的母液浓度，-20℃分装，使用前1∶10000稀释。

（11）分化培养基：向不含生长因子的N2培养基中加入终浓度为1μmol/L维甲酸和1μmol/L毛喉素，新鲜配制；或向不含生长因子的N2培养基中加入0.5%～1.0%的胎牛血清。

（12）防冻液：含有10%二甲亚砜的N2培养基，新鲜配制。

（13）多聚鸟氨酸溶液：用无菌的MiniQ水配制成10mg/ml的母液，-20℃分装保存，使用前用无菌的Mini Q水稀释成10μg/ml的工作浓度，新鲜配制。

（14）层粘连蛋白溶液：用无菌的磷酸盐缓冲溶液将其稀释成5μg/ml的终浓度，新鲜配制。

4.操作步骤

（1）小鼠脑DG和SVZ区的显微解剖（时间：30min）

① 用230mg/kg戊巴比妥钠麻醉成年小鼠，深度麻醉后断头取脑。

② 用无菌的眼科剪和眼科镊，依次剪开头皮，去除头颅骨，分离出完整的全脑，迅速将全脑移入50ml装有20ml预冷的Hank′s平衡盐溶液中，并置于冰上。切片前将脑移入装有预冷20ml溶液A的10cm的培养皿中。

③ 取鼠脑以前，用75%乙醇浸泡或擦拭消毒McⅡwain组织切片机中与组织接触的地方，并晾干。将灭菌的滤纸放在切片平台上，将鼠脑移入滤纸上，用McⅡwain组织切片机切脑片为400μm的厚度，用无菌试纸收集含有SVZ（约6片）和海马的脑片（约5片），移入含有5ml溶液A的6cm的培养皿中。

④ 如图1-10所示，在解剖显微镜下分离SVZ区［图1-10（a）～图1-10（c）］和海马的DG区［图1-10（d）～图1-10（f）］，将分离的区域分别移入装有10ml溶液A的15ml的离心管中。

注意：取出鼠脑以后的过程中，尽量全程使用冰浴，以提高细胞存活率。

（2）神经干细胞的分离（时间：1～2h，室温：20～25℃）

① 用低速离心机以200g，离心1min，第（4）步取得的脑组织。

② 在超净工作台内，去除上清液，每管中加入2ml的消化酶混合物1，用MACSmix离心管混匀器在室温下旋转20min。注意不能超过30min。

③ 每管中加30ml的消化酶混合物2，再旋转20min。注意不能超过30min。

④ 用1ml的吸头上下吹打10～20次，直至没有组织团块，加8ml N2培养基稀释消化酶混合物，200g，离心5min，以沉淀细胞。吹打时尽量减少气泡生成，尽量将组织块消化成单细胞悬液，消化的时间可适当的调整。

⑤ 用10ml的N2培养基，200g，离心5min，洗涤细胞2次。

⑥ 用8ml的起始增殖培养基洗涤细胞1次。

⑦ 用1ml的起始增殖培养基重悬DG区沉淀，接种于24孔细胞培养板的1个孔中，用2ml的起始增殖培养基重悬SVZ区沉淀，接种于24孔细胞培养板的2个孔中，CO2培养箱中培养48h。

⑧ 隔天半量更换起始增殖培养基，持续培养7～14天，检测神经球的形成情况。正常情况下1～2周形成神经球。

（3）神经干细胞的传代

① 培养7～14天后，收集原代培养的神经球，200g，离心5min。

② 小心去除上清液，用1ml的细胞消化液重悬神经球，37℃消化10min，用1ml吸头吹打神经球10～15次后，加8ml起始增殖培养基混匀，200g，离心5min。

③ 小心去除上清液，用1ml起始增殖培养基重悬DG区细胞，继续接种于24孔细胞培养板的1个孔中；用2ml起始增殖培养基重悬SVZ区细胞，接种于6孔细胞培养板的1个孔中。

④ 用新鲜的起始增殖培养基隔天半量换液DG区细胞，用N2培养基隔天半量换液SVZ区细胞。第二次传代后DG区细胞也可以使用N2培养基维持培养。第二次传代后，细胞接种密度介于（3×104～1×105）个/ml，每2～3天传代一次。干细胞可以在体外传20代以上，但推荐使用2～10代的干细胞进行后续的实验研究。

（4）神经干细胞的鉴定及增殖分析

① 神经干细胞表达Nestin蛋白，可将神经球接种于多聚赖氨酸包被的载玻片上，4%多聚甲醛固定20min、磷酸盐缓冲溶液漂洗3次后，用免疫细胞化学的方法检测Nestin蛋白的表达情况，代表性的结果见图1-11。

② 将单细胞悬液以2.5×104个/ml密度接种于超低黏附的细胞培养板中，完全培养基中加入2μmol/L BrdU，37℃培养24h后，免疫细胞化学方法检测BrdU掺入阳性率，代表性的结果见图1-11。

③ 神经干细胞的增殖分析也可直接在光镜下拍照后，测量神经球的数量和直径大小，代表性的结果见图1-12。

（5）神经干细胞的分化

① 诱导分化前两天，用工作浓度的多聚鸟氨酸包被培养板和盖玻片，室温孵育过夜。注意板不能风干。

② 去除鸟氨酸，用无菌MiniQ水漂洗板3次。

③ 加工作浓度的层粘连蛋白溶液，37℃孵育过夜，接种前去除多余的层粘连蛋白溶液。

④ 将消化好的神经干细胞以1×105个/ml密度接种，37℃培养过夜。

⑤ 用分化培养基半量换液细胞，每天半量更换培养基，连续4～7天。分化好的细胞可以直接裂解用于生化分析，也可用4%多聚甲醛固定后用于组化分析。神经干细胞可以分化为神经元和星形胶质细胞，通过免疫荧光检测神经元标志物β-Ⅲ-tublin和星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达情况。代表性的结果见图1-11。

（6）神经干细胞的冻存

① 收集神经干细胞球，200g，离心5min。

② 小心去除上清液，用1～2ml的防冻液重悬沉淀细胞，并移入2ml的冻存管中。

③ 将冻存管放置于冻存盒并移入-80℃冰箱中，1～2天后，将细胞移入液氮（-180℃）中长期保持。

（7）冻存神经干细胞的复苏

① 从液氮罐中小心取出冻存管，37℃水浴中轻轻摇动，直到防冻液完全融化。

② 将融化的细胞移入预温的N2培养基中，200g，离心5min。

③ 小心去除上清液，用预温的含有生长因子的N2培养基重悬细胞并接种培养。干细胞的冻存和复苏遵循“慢冻快融”的原则。

二、新生鼠海马神经干细胞的培养

成年鼠神经干细胞的增殖和分化能力明显低于新生鼠，在某些实验中需要培养海马区的神经干细胞，因此本文也解释新生鼠海马神经干细胞的培养要点，新生鼠海马神经干细胞的培养所需要的主要试剂和仪器与成年鼠神经干细胞的培养基本相同。

1.特殊试剂

木瓜蛋白酶、脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ）（终浓度20U/ml，购自Invitrogen）、溶解木瓜蛋白酶的平衡盐溶液（简称“溶木盐”，pH 7.2）（137mmol/L 氯化钠+5.3mmol/L氯化钾+1mmol/L氯化镁+25mmol/L葡萄糖+10mmol/L 羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液+3mmol/L 氯化钙）。

2.操作步骤

（1）消化液的配制：木瓜蛋白酶+脱氧核糖核酸酶Ⅰ+少许半胱氨酸+溶解木瓜蛋白酶的平衡盐溶液，混匀后37℃，使其变澄清，使用前无菌过滤。

（2）出生当天的小鼠，用75%酒精喷试后直接断头取脑，将全脑移入冰冷的A溶液中，在解剖显微镜下分离海马，去除脑膜。

（3）将海马移入消化液中，37℃消化20min，每5min晃动1次。

（4）静置沉淀后，小心弃除消化液，用10ml的N2培养基漂洗残留的消化液2次。

（5）加入2ml的N2培养基，使用1ml带滤芯的吸头反复的吹打、沉淀15～20次。

（6）静置沉淀后，小心将上清液移入另一无菌的离心管中；再次向沉淀中加入2ml的N2培养基，1ml带滤芯的吸头反复吹打、沉淀15～20次。重复该步骤，直至组织团块完全消失。

（7）收集所有的上清液，200g，离心5min，弃上清液。

（8）用10ml的N2培养基漂洗细胞两次，再用10ml的起始增殖培养基漂洗细胞1次。

（9）使用起始增殖培养基重悬神经干细胞，以每个海马种1个6孔细胞培养板的密度接种细胞，37℃二氧化碳培养箱中培养，2～3天后第一代的神经球形成。

新生鼠海马神经干细胞球前两代使用起始增殖培养基培养，第三代以后可以使用N2培养基培养。

新生鼠海马神经干细胞的传代、分化、冻存及复苏均与成年鼠神经干细胞相同。

三、胎鼠神经干细胞的培养

胎鼠来源的神经干细胞较新生鼠和成年鼠具有更高的增殖和分化潜能，因此很多实验中需要培养胎鼠神经干细胞。

胎鼠神经干细胞的培养所需的试剂和步骤与新生鼠海马神经干细胞的培养大致相同，只是取材的时间和部位不同，本文采用的是小鼠胚胎14天脑神经节的隆起处（ganglionic eminence，GE）培养胎鼠神经干细胞。GE区域的取材见图1-13所示。

参考文献

［1］Guo W, Patzlaff NE, Jobe EM, et al. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 2012, 7(11): 2005-2012.

［2］Chojnacki A, Weiss S. Production of neurons, astrocytes and oligodendrocytes from mammalian CNS stem cells. Nat Protoc. 2008, 3(6): 935-940.

（张　静）