第四节　原代神经胶质细胞培养

中枢神经系统中的胶质细胞，包括星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞。胶质细胞具有支持和引导神经元迁移，参与神经系统修复和再生的作用。星形胶质（astrocyte）细胞还具有营养作用，协助神经元的代谢；星形胶质细胞通过血管周足和突起连接毛细血管与神经元，对神经元起到运输营养物质和排除代谢产物的作用。少突胶质细胞的主要功能是在中枢神经系统中包绕轴突、形成绝缘的髓鞘结构、协助神经电信号的跳跃式高效传递，维持和保护神经元的正常功能。小胶质细胞（microglia）是神经胶质细胞的一种免疫细胞，相当于脑和脊髓中的巨噬细胞，是中枢神经系统中最主要的一道免疫防线。

一、星形胶质细胞的分离和培养

星状胶质细胞在神经胶质中体积最大，胞体呈星形，胞核大，呈圆形或卵圆形，染色较浅。由胞体伸出许多突起，其中有几个较粗的突起末端膨大（称脚板），贴附于毛细血管壁上，或附着在脑和脊髓表面形成胶质界膜。这种细胞在神经胶质细胞中数目多、功能多样。其重要功能是参与神经递质的代谢。此外，星状胶质细胞对中枢神经系统中离子平衡及神经系统的正常发育都有重要作用。本节介绍应用新生鼠（1～3天以内），采用急性分离、木瓜蛋白酶消化的方法培养星形胶质细胞。

1.实验对象

胎鼠［孕（18±2）天］、新生鼠出生0～2天。

2.实验材料

（1）器械：无菌培养瓶、培养皿、移液管、离心管、吸头、手术器械一套（眼科剪、眼科镊、显微镊等）。显微镊购于上海金钟，其余为常规耗材，无特别。

（2）试剂：DMEM/F12培养基（含有L-谷氨酰胺和15mmol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，较高质量）、多聚赖氨酸（Poly-D-lysine，购自Sigma，货号P-1274）、青霉素/链霉素溶液（100×，购自Hyclone，货号SU30010）、木瓜蛋白酶（Papain，购自Worthington），EDTA（100mmol/L，pH=7.2）、溶解木瓜蛋白酶的平衡盐液（137mmol/L氯化钠，5.3mmol/L氯化钾，1mmol/L氯化镁，25mmol/L葡萄糖，10mmol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，3mmol/L氯化钙，pH=7.2，以上生化试剂均购自Sigma公司）、75%酒精、4%多聚甲醛。

（3）试剂配制

① 培养基（500ml）：DMEM/F12培养液（450ml）加入胎牛血清（50ml）和青霉素/链霉素溶液（100×，5ml）。

② 木瓜蛋白酶溶液：以一只小鼠为例，配制1.5 ml溶解木瓜蛋白酶的平衡盐液+25ml木瓜蛋白酶 +30ml EDTA+少量的DNAase和左旋半胱氨酸，无菌过滤后，放于4℃冰箱中备用。

3.操作步骤

（1）包被：用多聚赖氨酸（25μg/ml）铺于培养瓶或培养板，使其完全覆盖底面，置于培养箱37℃包被2h或过夜，用超纯水清洗培养瓶或培养板3遍，置培养箱中待其干燥。星形胶质细胞的原代培养也可以不用包被。

（2）取脑：75%酒精全身消毒胎鼠或新生鼠，断头处死，无菌条件下分层剪开头皮、颅骨，用眼科镊拉开脑区视野，小心取出全脑，放于盛有冰冷溶解木瓜蛋白酶的平衡盐液的培养皿中。

（3）分离海马、皮质：以脑中线为起点，小心拨开大脑颞叶皮质，暴露出新月状海马回，小心夹出海马组织，分离皮质，在显微镜下用显微镊分离脑膜、血管膜。

（4）消化和分散：将皮质或海马组织置于装有木瓜蛋白酶溶液的离心管中，37℃培养箱消化20min，每10min晃动1次。吸弃消化液，用含血清的培养基洗3遍，再加入3～4ml培养基吹打10～15次，静置1min后，吸取上清液至另一干净的离心管中，再加3～4ml培养基吹打、沉淀10～15次，依次吹打直至沉淀完全分散成单细胞悬液。

（5）计数和接种：混匀吹打后的上清液，取少量细胞悬液以台酚蓝染液观察存活率并计数。将细胞种入预先包被多聚赖氨酸的培养瓶或培养皿中［（1～5）×106/ml，常规2对皮质可接种1～2个75cm2的大瓶］，置培养箱培养（37℃，5%二氧化碳，饱和湿度）。24h以后换液，之后每周换液2次。

星形胶质细胞的形态学观察：分散培养的单细胞，在接种1h后即可贴壁，细胞呈单个圆形或椭圆形。2～3天后细胞明显增大，突起长出。原代细胞培养10～14天后，显微镜下可观察到底层多角形、扁平、多个细长或粗短突起的细胞大多为星形胶质细胞。原代培养的星形胶质细胞每周更换培养液2次，在体外可维持培养很长时间。也可消化后接种于新的培养板或培养瓶中。细胞接种于盖玻片中，经4%多聚甲醛固定后，GFAP免疫细胞化学染色，胞浆着色，可见90%以上细胞呈阳性反应，图1-14、图1-15中为典型的星形胶质细胞染色。

（叶　冰　张　静　潘晓东）

二、新生鼠小胶质细胞的原代培养

小胶质细胞（microglia）是中枢神经系统中最具免疫学性质的细胞种类，数量为脑细胞总量的10%～12%。小胶质细胞介导的慢性炎症在阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化等神经变性疾病中起到重要作用，然而其确切的功能仍然不清楚。

尽管已经构建了多种永生化的小胶质细胞系如BV-2细胞或N9细胞，但在科学研究中，分离和培养新生鼠小胶质细胞是依然是研究该细胞各种属性的非常重要的手段。本节主要就介绍从新生1～3天的小鼠中急性分离获得混合胶质细胞体系，然后通过“振摇法”纯化获得小胶质细胞。通过该方法获得的小胶质细胞纯度在92%～98%。

1.操作步骤

（1）无菌条件下分离获得新生1～3天小鼠的大脑皮质和（或）海马。同时进行尾部活组织检查以确定小鼠基因分型。

（2）木瓜蛋白酶试剂，购自沃新顿（Worthington）公司，每瓶113～125U，加入20ml经过滤管过滤的DM试剂。加入0.1mol氢氧化钠至颜色变成橘红色。

注：DM试剂的配方如下。

（3）于显微镜下在HBSS或者无血清DMEM中剥除脑膜并将脑组织切碎。

（4）用刀片或尖镊将脑组织切成小块，并且于37℃下木瓜蛋白酶溶液（每个脑组织1ml）中孵育40min。

（5）加入等量的含有10%胎牛血清和 1%青霉素/链霉素溶液（100U/ml 青霉素，0.1μg/ml 链霉素）的DMEM终止消化。

（6）400g，离心5min，弃上清液，加入含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素溶液的新鲜DMEM培养基。

（7）用移液管重悬组织：先用10ml的移液管吹打8～10次，然后再用1ml的小头的移液管吹打30次。

（8）以每瓶2.5（2～3）个脑组织的密度将细胞接种于多聚赖氨酸包被的培养瓶中（每只培养瓶规格为底面积175cm2，75T），向其中加入含10%胎牛血清的DMEM培养基。

（9）37℃下在培养瓶中培养3h，去除所有的培养基和成纤维细胞，更换新培养基。7天后半量换液一次，并将细胞置于混合神经胶质培养基中培养14天。

（10）体外培养14天后，室温下以200转/分在摇床上摇45min，将小胶质细胞从混合培养细胞层里分离出。

（11）收集细胞上清细胞悬液，4℃，500g，离心8min（4℃最好，室温也可以）。

（12）在含有5%胎牛血清和1%青霉素/链霉素溶液的DMEM培养基中重悬细胞。

（13）用血细胞计数器计数分离到的小胶质细胞的总数（产量1），然后将细胞接种于细胞培养皿或者进行下一步实验。

（14）根据研究目的接种不同密度的细胞悬液

① 如果做免疫组化，则接种于24孔细胞培养板中底部已包被的盖玻片，每孔接种1×105个细胞，每个盖玻片上加200ml细胞悬液。

② 如果做蛋白印迹，则向12孔细胞培养板每孔接种（4～5）×105个细胞；6孔细胞培养板每孔接种（1～1.5）×106个细胞。

③ 如果提取RNA用，则向48孔细胞培养板每孔接种2×105个细胞；12孔细胞培养板每孔接种2×105个细胞。

④ 如果做MTT或者荧光多孔板分析，则向96孔细胞培养板每孔接种5×104个细胞。

（15）向混合胶质细胞培养瓶中加入含有10%胎牛血清和 1%青霉素/链霉素溶液的新鲜培养基培养一周，再次收集小胶质细胞（产量2）。此后可以再重复一次作为产量3。

2.注意事项

（1）小鼠年龄不能超过出生5天，出生5天不容易剥除血管和脑膜，出生当天得到的小鼠脑组织量少、产量低。

（2）选择商品化的培养瓶或者自己用0.01g/L多聚-L-赖氨酸包被至少2h。

（3）37℃下消化组织30～50min，消化成为棉花状或黏液状。

（4）对于不同的实验（ICC、WB、PCR），细胞的接种密度都很关键。

（5）对于小胶质细胞维持培养基，血清的浓度不要太高，低血清浓度较好，3%～5%为宜，不能超过5%。许多实验要求培养基不含血清。

（潘晓东　魏　振）

三、成年鼠小胶质细胞的分离和培养

虽然可以用许多不同的方法从新生鼠的大脑中分离培养小胶质细胞，但是从成年鼠脑分离小胶质细胞具有一定的挑战性，其往往产量低、分离困难。本文介绍一种从成年鼠大脑分离小胶质细胞的优化的方案。该方案先进行机械分离，然后在含有中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和脱氧核糖核酸酶Ⅰ中的培养基中进行酶解分离。通过不同密度梯度的细胞分离液（Percoll分层液）实现细胞分离。使用该方法分离的小胶质细胞可以培养后用于细胞功能测定，包括小胶质细胞分泌因子、趋化以及吞噬功能的检测，也用于细胞免疫组化、免疫荧光检测，以及流式细胞仪分析、分离RNA用于实时PCR或微阵列测定基因表达（基因芯片）、抽提蛋白质并通过蛋白印记检测目的蛋白表达。

1.背景知识

小胶质细胞起源于骨髓单核巨噬细胞系统，发育过程中迁徙至中枢神经系统，成为中枢神经系统内的巨噬细胞，在大脑免疫监视、环境应激和免疫应答中发挥着重要作用。中枢神经系统生理或病理事件可以通过募集周围血循环中的巨噬细胞刺激祖细胞分化迁徙或局部驻留的小胶质细胞增殖分化诱导大量的小胶质细胞产生，并同时导致血脑屏障的通透性增加。急性的小胶质细胞活化诱导神经营养因子的分泌，如神经胶质源性神经营养因子家族配体（GFLs），这类因子通过保护受损伤的神经元、协助修复减轻组织损伤。然而，异常活化的小胶质细胞也会产生过量的前列腺素、趋化因子、细胞因子和活性氧（ROS）和活性氮（RNS），包括一氧化氮（NO），通过增强氧化应激并激活细胞凋亡途径而对神经元存活产生有害的影响。如果小胶质细胞活化长期持续继发慢性炎症反应，将导致组织损伤。

本方案介绍一种从成年鼠大脑完整分离小胶质细胞的方法（对原有的培养方法进行改良）。使用这种方法分离的小胶质细胞，适用于在体外研究小胶质细胞的神经保护和神经毒性活性两者间的调节平衡机制。

2.材料

用冷磷酸盐缓冲溶液灌注的成年鼠大脑（＞8周）：50ml灌注、Hank′s平衡盐溶液（不含钙和镁）、Hank′s液体（10×Hank′s平衡盐溶液）、脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ）（终浓度20U/ml，购自Invitrogen）、中性蛋白酶Ⅱ（Dispase Ⅱ，终浓度1.2U/ml，购自Roche）、木瓜蛋白酶（1mg/ml，购自Sigma-Aldrich，或125U/vial，购自Worthington）、青霉素/链霉素溶液（100×，组织培养级）、Percoll分层液。

3.培养基和溶液

（1）培养基（50ml）：49.5ml Hank′s平衡盐溶液+0.5ml青霉素/链霉素溶液（100×）（使用前或者混合后无菌过滤）。

（2）葡萄糖：准备含葡萄糖0.45g/ml磷酸盐缓冲溶液（100×），取450ml加入50ml磷酸盐缓冲溶液中使终浓度4500mg/L。

（3）无血清培养基（50ml）：49ml DMEM/F12培养基+0.5ml青霉素/链霉素溶液（100×）+0.5ml葡萄糖（100×）。

（4）中和培养基（50ml）：44ml DMEM/F12培养基+0.5ml青霉素/链霉素溶液（100×）+0.5ml葡萄糖（100×）+ 5ml加热灭活的胎牛血清。

（5）培养基（50ml）：44.5ml DMEM/F12培养基+0.5ml青霉素/链霉素溶液（100×）+ 5ml加热灭活的胎牛血清。

（6）中性蛋白酶Ⅱ：将冻干的酶溶解于羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液（50mmol/L 羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液/氢氧化钾pH 7.4，150mmol/L氯化钠）（10mg/ml）使用时用细胞培养液稀释到2.4U/ml。不推荐高于2.4U/ml的工作浓度。0.22μm的无菌滤膜过滤除菌。

注：（1）～（6）中所有的培养基和溶液在使用前或混合后需无菌过滤。

（7）分离培养基：脱氧核糖核酸酶、中性蛋白酶（DDP）试剂备用。（①0.028g木瓜蛋白酶，终浓度1mg/ml；②14ml DMEM/F12培养基；③14ml预制的中性蛋白酶，终浓度1.2U/ml）保存于-20℃。使用前立刻加入脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ）溶液（终浓度20U/ml）。

（8）准备细胞分离液 SIP，90% Percoll分层液，即9份细胞分离液和1份10× HBSS，如1ml 10×HBSS+9ml Percoll分层液，不同浓度梯度的分离液的配方见表1-1。

4.操作步骤

（1）新鲜灌注的成年鼠脑放入装有2ml无血清培养基的35mm×10mm培养皿中。然后用15T#手术刀片尽可能精细地切碎。

（2）将切碎的组织移入装有3ml分离培养基的15ml试管中。

（3）在组织培养箱轻轻摇晃细胞悬液20min，或者每隔5min颠倒1次试管。

（4）往分离培养基中加入5ml中和培养基，以中和其中的酶。

（5）在室温下，250g，离心5min。

（6）缓慢取出培养基（要非常小心，以免弄浑沉淀物，因为沉淀物很容易被吸入移液管）。

（7）把沉淀物置于5ml无血清的培养基中。重复步骤（5）和（6）。

（8）加入3ml DMEM/F12细胞培养液，用抛光大号带孔的巴斯德移液管上下吹打混匀，直到大块组织都溶解。静置1min，待大块组织沉淀。把上层清液（含有游离细胞）移入新的15ml锥形试管内，并将它保存在冰箱里。

（9）加入3ml DMEM/F12细胞培养液，用抛光的巴斯德移液管（中号带孔）上下吹打，混匀，直到大块组织都溶解。静置1～2min直到大块组织沉淀下来。把上层清液倒入事先装有细胞悬液的收集管，保存在冰箱里。

（10）加入2ml DMEM/F12细胞培养液，用抛光的巴斯德移液管（小号带孔）吹打，混匀组织。静置1min，直到大块组织沉淀。

（11）将上层清液（含有游离细胞）跟事先准备好的细胞悬液混匀。

（12）用2ml DMEM/F12细胞培养液润湿70μm细胞过滤器，然后用细胞过滤器过滤细胞悬液。

（13）250g，离心4min。

（14）将细胞置于5ml DMEM/F12细胞培养液中，250g，离心4min，去除上层清液。

（15）再将细胞团置于37% Percoll分层液。

（16）将4ml 37%SIP［从第（4）步开始］加入15ml锥形试管并缓慢地将4ml 70%细胞分离液衬于下层［见注释（1）］，然后缓慢地用移液管将4ml 30%细胞分离液加在37%液的上面，再将2ml HBSS加在它上面。

（17）用梯度离心机300g不间断离心40min（18℃）。确保离心机工作不会中断，这样细胞间的界面才不会被打乱。

（18）用移液管缓慢地移除细胞碎片，收集2.0～2.5ml的70%Percoll分层液至37%Percoll分层液的中间相细胞并置于干净的15ml锥形试管中。

（19）每2ml的中间相细胞加入6ml HBSS，这样可以确保含中间相细胞的细胞分离液被稀释3倍。

（20）4℃，500g，离心7min。

（21）将细胞团重新溶解于500ml HBSS，移至小的0.6ml或者1.5ml EA管中，用500ml的液体在微型离心机上4℃，800g，离心清洗3遍。

（22）用细胞计数器计数细胞，将细胞种植在培养基上，便于免疫细胞分析和功能分析［见注释（2）～（4）］。

成年鼠小胶质细胞的细胞分离梯度设置原理见图1-16。

（潘晓东）