第二节　新生小鼠中脑多巴胺能神经元培养

中脑或腹侧被盖区多巴胺能神经元的培养用于研究多巴胺能神经元的发育和功能，也用于研究不同的多巴胺能的调节机制。本节主要介绍在单层星形胶质细胞表面培养新生鼠多巴胺能神经元的方法。星形胶质细胞的存在能够为多巴胺能神经元的生长提供与在体类似的环境，对于多巴胺能神经元各种特性的产生很关键。本节介绍两种新生鼠中脑多巴胺能神经元的培养方法。一种是基本方法，包括三个关键步骤：①包被玻片；②原代单层星形胶质细胞的培养；③原代中脑多巴胺能神经元的培养。这种方法建立起多巴胺能神经元与中脑内的其他类型神经元相互联系的神经元网络。该方法适用于多巴胺能神经元功能与机制的生理、药理、生化和分子等层面的研究。另外一种方法是准备一个微细胞培养环境，这种方法适用于研究单个或几个多巴胺能神经元，它们之间形成突触联系，研究人员可以分析各种突触结构与物质运输机制。

一、单层皮质星形胶质细胞表面培养新生鼠中脑多巴胺能神经元

选取出生后0～3天的小鼠进行星形胶质细胞的培养，将小鼠麻醉后剥离头皮和背侧颅骨，获得脑组织，分离获得前脑。酶消化、机械分离组织、悬浮细胞，涂片之后在培养皿中孵育24h。然后用预冷的液体振摇，去除其余类型的神经元和小胶质细胞。细胞之间一旦接触生长，则收集星形胶质细胞，接种在事先用胶原-多聚赖氨酸包被的玻片上，并等待星形胶质细胞在玻片上聚集接触。第二步是培养多巴胺能神经元，选取出生后0～2天的小鼠，按照如上星形胶质细胞的方法获得小鼠脑，切取部分中脑和黑质与腹侧被盖区脑组织。酶消化之后、机械分离组织、收集细胞，重悬，以合适的浓度种植。

第二天，向培养基中加入有丝分裂抑制剂阿糖胞苷（Ara-C），抑制星形胶质细胞和小胶质细胞增殖。

整个过程在培养箱（37℃，5%CO2）中进行。具体操作见图1-2。

（一）材料准备

（1）试剂：12mol/L的浓盐酸；无菌过滤水；95%和70%的乙醇；胶原溶液1；多聚赖氨酸溶液；MEM培养基（Invitrogen）；分离溶液；木瓜蛋白酶；有丝分裂抑制剂阿糖胞苷；EDTA（Invitrogen）；磷酸盐缓冲溶液（PBS）；0.5%胰蛋白酶；0.4%台酚蓝；条件培养基；氟尿苷；犬尿喹啉酸；75%酒精。

（2）器材：直径1.5cm的玻片；分离器械（Fine Science Tools）：眼科剪（2把）、眼科镊（2把）、7号弯镊1对、7号和5号弯钳、刀片、酒精灯；90mm孔径的滤纸（紫外灯消毒）；0.2μm孔径的注射器过滤器；紫外线灯；100mm×15mm和35mm×10mm培养皿；10ml注射器；高压灭菌锅；5ml和10ml移液管；铝箔纸；倒置显微镜；3个25cm2的培养瓶；175cm2培养瓶；可放入15ml离心管的离心机；血细胞计数器，电烙铁。

（二）操作步骤

1.包被玻片

（1）将玻片放入12mol/L浓盐酸浸泡24h。

（2）用无菌过滤水冲洗3遍，之后在无菌水中浸泡1h。

（3）95%乙醇洗3遍，最后浸泡到乙醇中至使用前取出（玻片置于盛有95%乙醇的密闭容器中可放置几周，如果发现液体变黄，则要将玻片丢弃）。

（4）用7号弯钳将玻片逐一从95%乙醇中取出，放到新鲜的95%乙醇中浸泡后用酒精灯烤干。

（5）小心地将玻片放到100mm×15mm无菌培养皿中用紫外灯消毒过的无菌滤纸上（注意观察玻片是否透明，如果不透明则丢弃，否则细胞不易爬片）。

（6）用10ml注射器吸一滴新鲜的胶原溶液1，通过0.2μm孔径的过滤器滴到每一个玻片上，用7号弯钳夹住吸头将其铺匀，直至晾干。

（7）按照滴加胶原溶液1的方法将65ml多聚赖氨酸溶液滴加到玻片上，放入密闭的玻璃皿中1h（注意此过程中多聚赖氨酸不能晾干）。

（8）将玻片依次放入3个盛有无菌细胞培养水的烧杯中，然后将它们分别放到用紫外灯消毒过的无菌滤纸上，向每张玻片上滴加65ml无菌水，盖好培养皿，静置1h，同样方法重复一次，吸干玻片上多余的无菌过滤水至玻片完全晾干。

（9）每个35mm×10mm的培养皿中放入两个玻片并用电烙铁在培养皿上画一条中线以免两张玻片重叠（图1-3）。

注意：（7）～（9）要在一天内完成，包被的玻片要在一周内使用完。

（10）在接种星形胶质细胞之前，提前至少3h在玻片上滴加100ml MEM培养基。

2.培养单层星形胶质细胞

（1）器械和操作台的准备

① 用高压灭菌锅灭菌器械或用70%乙醇浸泡之后烘干备用。

② 向35mm×10mm的培养皿中加入2ml分离溶液，并置于冰上备用。

③ 准备抑制剂和5ml木瓜蛋白酶。

④ 将2根5ml的玻璃吸管放到酒精灯上烧至其口径分别变小为1.5mm和0.5mm。

（2）分离组织

① 将新生鼠放到碎冰上的铝箔纸上麻醉，一旦小鼠停止活动，用70%乙醇消毒其头颅，然后用吸水纸吸干；如图1-4所示，用眼科剪从颈部开始，以圆形走形剪开头皮和背侧颅骨；用7号弯镊去除皮肤和颅骨，暴露脑，用2ml分离溶液冲洗脑组织，用烧至弯曲的玻璃吸管将脑组织轻轻拉出，放入盛有预冷的分离溶液的培养皿中。

② 将脑组织放到倒置显微镜下，背侧向上，用5号弯钳夹住脑，用刀片切下前脑。

③ 小心分离出中脑，将脑膜连同所有血管剥下。

④ 将前脑切成许多组织块，以便均匀消化。用10ml的无菌玻璃吸管将组织块转移到盛有事先激活的木瓜蛋白酶的15ml离心管中，将其放到可以入水的磁力搅拌器上于37℃温水中水浴50min（搅拌过程可以借助向烧杯中加入几个磁力转子来加大搅拌力量）。注意在转移组织块时尽量少的吸取分离溶液，以免其将木瓜蛋白酶稀释。

（3）分离星形胶质细胞

① 使组织块自然下沉，将木瓜蛋白酶小心吸出，用2.5ml的抑制剂冲洗组织块2次。

② 用2ml的MEM培养基冲洗组织块2次，之后向离心管中加入1ml MEM培养基，用1.5mm口径的5ml玻璃移液管反复吹打组织块20次，之后换用0.5mm口径的5ml玻璃移液管吹打40次，若发现仍有组织块未完全消化，则分离细胞悬液和沉淀，将悬液吸取到另一个15ml的离心管放到培养箱保存，向剩余沉淀中加入1ml MEM培养基再次像之前一样吹打，至均匀将其与细胞悬浮液混匀。

③ 向上述的细胞悬浮液中加入MEM培养基至体积为25ml，吸取15ml平均分到3个25cm2的培养瓶中，剩余10ml加入到175cm2的培养瓶中过夜。前三者用于提供中脑多巴胺能神经元生长所需的星形胶质细胞单层，后者用于形成MEM条件培养基。

（4）预冷

① 细胞分离后的第二天，将培养瓶中的培养基吸出，25cm2和175cm2的培养瓶分别加入2ml和10ml１×MEM培养基洗2次，左后分别加入5ml和100ml MEM培养基即可。

② 之后将培养瓶放入细胞培养箱中至细胞接触生长，这个过程一般需要7天，然后将星形胶质细胞转移到玻片上。

③ 准备胰蛋白酶：向25cm2的培养瓶中加入7ml预热的EDTA溶液和2ml磷酸盐缓冲液。

④ 酒精灯上烧5ml的玻璃吸管至其口径减少至0.5mm。

⑤ 准备0.5%的胰蛋白酶。

⑥ 吸出每个培养瓶中的培养基弃去，分别加入2ml EDTA溶液，轻轻吹打十余次。然后弃去EDTA，再分别加入2ml的EDTA。此步是为了去除血清蛋白，以免其干扰胰蛋白酶对星形胶质细胞的分离，根据经验，在用胰蛋白酶消化之前，用EDTA处理比用磷酸盐缓冲液处理更能增加其消化效果。

⑦ 弃去EDTA溶液，向每个25cm2的培养瓶中加入2ml提前激活的0.5%的胰蛋白酶，孵育5min后观察细胞是否分离；若没有分离则继续孵育至分离。

⑧ 向每个培养瓶中加入2ml的EDTA溶液将胰蛋白酶稀释，然后用0.5mm口径的10ml玻璃管轻轻吹打十余次。

⑨ 将细胞悬液转移到15ml的离心管中，向培养瓶中加入1ml EDTA覆盖剩余的细胞，然后将其转移到15ml的离心管中。

⑩ 三步离心法：室温下以200g离心2min，300g离心2.5min，900g离心30s。此三步的目的是将离心时间和机械损伤降到最小，同时有效分离出上清液以及细胞碎片。因此，前两步离心是将细胞碎片分离出，最后一步是将其沉淀，分离出上清液。

⑪ 弃去上清液，向每个离心管中加入1ml MEM培养基，用0.5mm口径的5ml玻璃移液管轻轻吹打二十余次。

⑫ 用血细胞计数器和台盼蓝计数细胞。

⑬ 将细胞悬液稀释到需要的浓度：1×105cells/ml。

⑭ 向每个事先包被过的玻片上涂布130ml的细胞悬液，孵育3h；这3h的孵育是为保证在将玻片转移到含有2.5 ml培养基的培养皿之前，使细胞附着玻片的同时还防止其干燥。

⑮ 向培养皿中加入含MEM培养基和MEM条件培养基各一半的溶液共2.5ml，继续孵育，注意此步要小心操作，以防止贴壁的细胞分离。

⑯ 细胞成功贴壁并且接触生长之后，向培养皿中加入12.5ml的氟尿苷。氟尿苷是一种抗肿瘤药，它的作用是延缓胶质细胞增殖，以便其形成单层，使神经元细胞附着。此步骤是否需要进行取决于新生小鼠的出生日期，氟尿苷加入之后可以使胶质细胞在几天内保持单层，如果神经元细胞恰好也培养好，则不需要此步便可直接涂片在星形胶质细胞单层上。

3.在星形胶质细胞单层培养中脑多巴胺能神经元

（1）器械与超净台准备

① 分离器械在高压灭菌锅灭菌或用70%的乙醇浸泡后烘干。

② 酒精灯上将2根5ml的玻璃吸管烧至口径分别为2mm和0.5mm。

③ 向35mm×10mm培养皿中分别加入2ml分离溶液，每个培养皿中加入两个脑组织，并置于冰上操作。

④ 用10ml注射器吸满分离溶液备用，每个脑组织5ml。

⑤ 准备离心用溶液（5ml/5个脑组织），研磨液（10ml/5个脑组织）和MEM培养基（2.5ml/2个玻片）。

⑥ 每5个脑组织准备5ml激活的木瓜蛋白酶溶液。

（2）解剖分离

① 取出生后0～2天的新生鼠按照培养单层星形胶质细胞的分离组织的方法①分离脑组织。

② 将脑组织腹侧面向上置于倒置显微镜下（图1-5），头端以中脑皱褶为参照，尾端以Willis环为参照，在冠状面切下大约1mm厚的薄片（图1-6），大体位置如图1-7所示。

③ 用刀片切下腹侧被盖区和黑质部分。

④ 将脑组织块收集到预冷的分离溶液中，按此操作准备5个脑组织。

⑤ 用10ml的玻璃吸管将脑组织块转移到盛有提前激活的木瓜蛋白酶的15ml离心管中，将离心管放到37℃水浴锅中搅拌水浴。确保在转移组织块的过程中，尽量少的吸取分离溶液，以免将木瓜蛋白酶稀释。

注意：细胞的存活率与操作速度是相关的，建议两个人一起操作，一人负责取脑组织，另一个负责分离中脑。

（3）分离细胞

① 使组织块自然下沉，小心吸出木瓜蛋白酶，用室温下的分离溶液冲洗组织块两次。

② 再用2ml的研磨溶液冲洗组织块2次，之后向离心管中加入1ml研磨溶液，用1.5mm口径的5ml玻璃吸管研磨组织块20次之后换用0.5mm口径的5ml玻璃吸管研磨40次。若发现仍有组织块未完全消化，则参照培养单层星形胶质细胞的分离组织的方法②，只是将MEM培养基换成研磨溶液。

③ 将含有5个经酶消化过的脑组织的细胞悬液小心地滴加到5ml的离心溶液中，确保每根管的体积相同。然后以下面转速离心：室温下200g，离心2min，300g，离心3min。本操作的目的同前。

④ 弃去上清液，每根管加入500ml研磨溶液，重悬细胞。

⑤ 用血细胞计数器和台酚蓝计数细胞。

⑥ 稀释细胞悬液到所需要的浓度：一般是（1～3）×105cells/ml。

⑦ 用7号弯钳将培养有单层星形胶质细胞的玻片从培养皿中夹出，放在用紫外灯消毒过的滤纸上将底面液体吸干，然后将其放到紫外灯消毒过的新的10mm×35mm的培养皿中，用如前所述的方法在培养皿中央用电烙铁画一条线，将两个玻片分隔开，最后向每个玻片上滴加65ml的中脑多巴胺能神经元细胞悬液，培养箱中孵育3h。为防止已经贴壁的单层星形胶质细胞干燥，此步要两个人来完成，一次性摆好5个培养皿，不时地用移液管吹打剩余的细胞悬液而防止其形成沉淀。

⑧ 孵育完成之后，向每个培养皿中加入2.5ml的Neurobasal-A+/MEM+培养基过夜，注意此步小心操作，以免将细胞分离。

⑨ 之后向每个培养皿中加入12.5ml氟尿苷，以减慢胶质细胞进一步增殖，由于此时的细胞悬液中包括胶质细胞和神经元两种，所以加入氟尿苷防止其增殖是很有必要的。

⑩ 接种上神经元后的第7天，向培养皿中加入10ml犬尿喹啉酸，防止其与谷氨酸受体结合以及兴奋性谷氨酸中毒，然后加入500ml Neurobasal-A+/MEM+培养基，防止蒸发，继续孵育。

⑪ 之后每周都要向培养皿中加入500ml Neurobasal-A+/MEM+，以防止液体蒸发。此培养持续60天，细胞贴壁期间都可以通过免疫细胞化学法检测酪氨酸羟化酶的浓度以测定多巴胺能神经元的比例（图1-8）。正常情况下，应该保持在20%～25%。

二、单层星形胶质细胞表面培养新生鼠中脑多巴胺能神经元及形成神经突触

该方法是在小部分星形胶质细胞表面培养多巴胺神经元。总体方法是在玻片上喷洒胶原基质，形成星形胶质细胞可以附着的微滴。这样多巴胺能神经元就可以附着在星形胶质细胞上生长。在这种模型中，孤立的神经元可以与其细胞体和树突形成突触联系，称为“自身突触”。这种模型可以用来进行突触结构与功能的定量研究。

（一）补充材料（与单层皮质星形胶质细胞表面培养新生鼠中脑多巴胺能神经元相比需要的材料）

多聚鸟氨酸溶液，0.15%琼脂糖溶液，胶原溶液2，薄层色谱试剂喷雾器（Kimble/Kontes）。

（二）操作步骤

⒈包被玻片

（1）同单层皮质星形胶质细胞表面培养新生鼠中脑多巴胺能神经元包被玻片的（1）～（5）。

（2）把100ml新鲜配制的多聚鸟氨酸溶液滴加在每个玻片上，用7号弯钳夹住移液管，利用其末端将溶液展开使其覆盖在玻片的整个表面。在37℃下培养24h。

（3）吸出多聚鸟氨酸溶液，代之为100ml水，室温下放置5min。重复清洗，在开始下一步之前，将其放到用紫外灯消毒过的滤纸上静置24h。

（4）用巴斯德移液管把加热过的0.15%琼脂糖溶液滴加到玻片上，一次5张玻片。吸出多余的0.15%琼脂糖溶液，仅仅只留下薄薄的一层。在开始下一步之前晾干24h。

注意：0.15%琼脂糖溶液在使用之前，为了减少它的黏度必须加热，这样才能更容易地铺成薄薄的一层。当0.15%琼脂糖溶液开始变得越来越黏稠的时候，有必要对其进行重复加热。

（5）在接种星形胶质细胞的前一天，要用胶原溶液2处理玻片；将薄层色谱试剂喷雾器的气压设置为45psi。盛有玻片的培养皿放在喷雾器的50cm以外、比它低20cm以下的位置。最后，胶原溶液2垂直地落在玻片上形成小圆点。见图1-9。

（6）紫外灯照射玻片消毒30min并干燥。每一个紫外灯消毒过的35mm×10mm的培养皿中放置两个玻片，然后将100ml MEM培养基滴加在玻片上。

2.玻片上培养少量星形胶质细胞

（1）重复单层皮质星形胶质细胞表面培养新生鼠中多巴胺能神经元的培养单层星形胶质细胞（1）的①至（4）的⑫。

（2）稀释细胞悬液到需要的浓度（6×104cells/ml）。

星形胶质细胞的量至关重要，但无需过多，形成平滑稀薄的一层即可，这对细胞成像等技术很重要。

（3）重复单层皮质星形胶质细胞表面培养新生鼠中多巴胺能神经元的培养单层星形胶质细胞（4）的⑭和⑮。

（4）一旦神经胶质细胞延伸覆盖在整个玻片表面后，一般是在涂片后一天，立即添加12.5ml氟尿苷溶液。

3.星形胶质细胞表面培养新生鼠中脑多巴胺神经元

（1）重复单层皮质星形胶质细胞表面培养新生鼠中多巴胺能神经元的在星形胶质细胞单层中培养脑多巴胺能神经元（1）的①至（3）的⑤。

（2）稀释细胞悬液到所需的浓度（80000cells/ml）。

（3）重复单层皮质星形胶质细胞表面培养新生鼠中多巴胺能神经元的在星形胶质细胞单层中培养脑多巴胺能神经元（3）的⑦至（3）的⑪。

这种培养可以保持15天以上。

三、本节实验中使用到的试剂和溶液

（1）0.15%琼脂糖溶液［20ml水、30mg琼脂糖（购自Sigma）］：在微波炉上加热至出现沸腾的气泡，然后搅拌至琼脂糖粉溶解。

（2）多聚-L-赖氨酸硼酸盐溶液［50ml水、155mg硼酸（购自Sigma）、238mg硼砂（四硼酸钠+水合物）（购自Sigma）］：用1mol/L的盐酸调整pH值为8.5，使用0.2μm过滤器过滤，4℃下保存3周。

（3）多聚-L-鸟氨酸硼酸盐溶液［50ml水、2.38g硼酸（购自Sigma）、1.27g四硼酸钠水合物（购自Sigma）］：使用0.2μm过滤器过滤，4℃下保存3周。

（4）离心分离溶液［5ml Neurobasal-A+、50mg胰蛋白酶抑制剂、50mg 98%的牛血清白蛋白、11.9mg羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）缓冲液，最低浓度99.5%］：用1mol/L的氢氧化钠调整pH为7.4，使用0.2μm 过滤器过滤，置于二氧化碳保温箱加热到37℃，现用现配。

（5）胶原溶液1［7.25ml水、250ml PureCol（3.0mg/ml；购自Inamed Biomaterials）］：现用现配，可用于包被方法1中的至少100张玻片。

（6）胶原蛋白溶液2［3ml 125mmol/L醋酸、1ml PureCol（3.0mg/ml；购自Inamed Biomaterials）］ ：现用现配，可用于包被方法2中的至少100张玻片。

（7）MEM+条件培养基（MEM条件培养基和10% 胎牛血清培养基）：按照方法2中的步骤在175cm2的烧瓶中接种星形胶质细胞。则条件培养基在合适的条件下经14天将逐渐形成。

（8）D-葡萄糖MEM培养基［50ml最基本的培养基、18.02g D-葡萄糖（购自Sigma）］：使用0.2μm过滤器过滤，37℃下保存3个月。

（9）分离介质（6.39g硫酸钠、2.62g硫酸钾、590mg氯化镁六水合物、18.4mg氯化钙二水合物、1.19g羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液、1.80g D-葡萄糖）：

① 加水至总体积为500ml，在磷酸盐缓冲液中加入0.5%的酚红溶液。

② 用1mol/L 氢氧化钠调整pH为7.4，使用0.2μm过滤器过滤，4℃下保存1个月。

硫酸钠、硫酸钾、氯化镁、氯化钙、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液、D-葡萄糖、酚红均购自Sigma公司。

（10）氟尿苷溶液（203ml基本培养基、100mg 5-氟-2脱氧尿苷、198mg尿苷）：使用0.2μm过滤器过滤。分装成每管1ml可在-20℃下储存一年。

（11）抑制剂（5ml MEM+培养基、12.5mg胰蛋白酶抑制剂、12.5mg 98%的牛血清白蛋白、23.8mg 最低浓度99.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液）：用1mol/L氢氧化钠调整pH值为7.4，用0.2μm过滤器过滤，把溶液放置在二氧化碳保温箱中加热到37℃，现用现配。

（12）125mmol/L犬尿喹啉酸（10ml水、236.5mg犬尿喹啉酸）：加入5mol/L氢氧化钠直到粉末溶解。使用0.2μm过滤器过滤。分装成200ml 每管-20℃储存一年。

（13）MEM+培养基（MEM/10% 胎牛血清介质）［85.7ml基本培养基、1ml D-葡萄糖MEM、1ml青霉素/链霉素（购自Invitrogen）、1ml GlutaMAX（购自Invitrogen）、1ml 100mmol/L的丙酮酸钠、100ml MITO+］：在 DPBS中加入200ml 0.5%的酚红溶液。使用0.2μm过滤器过滤。10ml胎牛血清。37℃下保存一周。

（14）MITO+［5ml水、1瓶MITO+血清添加物配成5L的培养基（购自BD Biosciences）］：分装成100ml每管，-20℃下储存一年。

（15）Neurobasal-A+培养基（Neurobasal-A和10% 胎牛血清）［86ml Neurobasal-A培养基 1×（无L-谷氨酰胺）、1ml青霉素-链霉素、1ml GlutaMAX、2ml B27补充物、10ml胎牛血清］：使用0.2μm过滤器过滤，37℃下保存一周。

（16）Neurobasal-A+/MEM+培养基（66ml Neurobasal-A+、33ml MEM+条件培养基）：37℃下保存一周。

（17）木瓜蛋白酶溶液［5ml分离溶液、2.25mg L-半胱氨酸盐酸盐化合物（购自Sigma）］：用1mol/L氢氧化钠调整pH值为7.4。100U木瓜蛋白酶（购自Worthington）。不晃动使其在37℃下活化15min，然后连接到直径26mm注射器上的0.2μm SFC过滤器过滤并在37℃下最多储存30min，现用现配。

（18）多聚-L-赖氨酸（5ml硼酸缓冲聚-L-赖氨酸、5mg多聚左旋赖氨酸）：分装成每管200ml。在-20℃下储存两年。

（19）多聚赖氨酸溶液（1.8ml硼酸缓冲聚-L-赖氨酸、200ml L-半胱氨酸盐酸盐等分）：现用现配。

（20）多聚-L-鸟氨酸（2.5ml水、25mg多聚-L-鸟氨酸）：分成每管30ml。在-20℃下储存两年。

（21）多聚-L-鸟氨酸溶液（用75盖玻片）（6.72ml水、750ml多聚-L-鸟氨酸硼酸盐溶液、30ml多聚-L-鸟氨酸）：现用现配。

（22）研磨溶液（20ml Neurobasal-A+、20mg胰蛋白酶抑制剂、20mg 98%的牛血清白蛋白、47.6mg最低浓度99.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液）：用1mol/L氢氧化钠调整pH值为7.4，使用0.2μm 过滤器过滤。把溶液放置在二氧化碳保温箱中加热到37℃，现用现配。

（23）0.5%胰蛋白酶溶液［10ml 37℃的磷酸盐缓冲溶液、5mg胰蛋白酶（1∶250，购自Invitrogen）］：使用0.2μm 过滤器过滤并在37℃下放置5min，现用现配。

四、注意事项

（1）尽快地进行解剖和活体组织的分离。快速解剖和处理组织将确保游离神经元的高存活率，并产生高比例的存活多巴胺神经元。因此，以两人为一组的形式有利于执行所有关键步骤。

（2）动物的年龄。虽然出生后0～3天的小鼠均可使用，但是为了获得更高比例的多巴胺能神经元和一个更长的生存期，使用出生后0～1天的更优。另外，为获得高比例的多巴胺能神经元（50%以上），准备一个稍微更薄和最佳区域的中脑切片。

（3）培养基中所用的血清。大量的劣质血清可降低出生后小鼠多巴胺神经元的存活率。当预备进行出生后小鼠的多巴胺神经元的培养时，有一个好办法是先测试多个血清，并选择其能达到多巴胺能神经元最长存活期的血清。

五、常见问题及解决方案

最常见的问题是多巴胺能神经元的存活率低。使用本节中描述的基本数据，一般可获得25%～ 30%的多巴胺神经元。如果所得比例远远低于此值，则操作过程值得探究。

这通常有以下四个可能的原因：

（1）解剖分离时间过长。

解决方法：两人一起操作共同获得部分脑组织。

（2）转移神经元悬浮液到星形胶质细胞玻片上的使用过长时间。

解决办法：如上所述，团队合作。此外，每次准备少量的载玻片。

（3）过高或低的细胞密度。平铺星形胶质细胞时密度过高或过低都会导致神经元的生存率无法达到理想结果。

解决办法：严格遵守本报告中的建议。

（4）实验动物月龄过大。使用月龄过大的动物进行实验时，尽管可以优化酶消化法和机械分离法的条件，但目前的实验表明，出生0～2天的大鼠或小鼠幼崽是最为适合使用的动物年龄。使用月龄较大幼崽将会导致多巴胺神经元的生存率降低。

除此之外，多巴胺能神经元的比例过低也可能因为解剖分离脑组织时并没有正确分离出中脑。

六、预期结果

通过方法1每个玻片有200～500个多巴胺神经元。其中较成熟的神经元之间能够形成一个复杂的轴突和树突网络。方法2会产生单个多巴胺神经元或一小部分神经元。每个玻片上有10～20个多巴胺神经元。

七、时间因素

经过24h的浓盐酸浸泡，酒精灯烘烤和包被后，玻片可以使用 6～10h，具体取决于准备了多少。对于微量细胞培养的玻片，需要额外的48h来进行孵育和干燥。然后，麻醉动物、分离皮质、分离细胞、将星形胶质细胞接种至烧瓶中需要2h。星形胶质细胞经过 1 周孵育后，需要4～6h准备玻片和接种星形胶质细胞，加入培养基需要额外的3h的孵育时间。星形胶质细胞在标准玻片（3～5天）或微量细胞培养玻片（24h）还需要一定的时间。最后，培养多巴胺能神经元，用3h分离5～10只动物脑组织，包括麻醉、分离组织、分离细胞、接种，在加入培养基之前再孵育另外3h。每只动物分离脑组织和中脑的最佳时间不应超过1.5min，以减少多巴胺能神经元的死亡。

参考文献

Fasano C, Thibault D, Trudeau LE. Culture of postnatal mesencephalic dopamine neurons on an astrocyte monolayer. Curr Protoc Neurosci. 2008, Chapter 3: Unit 3.21.

（宋　悦　潘晓东）