第一章　原代神经细胞培养和细胞功能测定

第一节　原代皮质和海马神经元培养

皮质和海马神经元是最常用于神经功能检测的神经细胞类型。分离后的神经元可以用于细胞毒性试验、观察细胞存活、突触形态学、细胞转染等离体实验，也适用于神经电生理、药理学的研究。海马因受解剖结构的影响，取材小、因此获得率较低。通常情况下皮质和海马的原代神经元在形态学上不会有太明显的区别。本节介绍应用新生（24h以内）或孕17～19天的胎鼠，采用急性分离、木瓜蛋白酶消化的方法培养皮质和海马神经元，并结合免疫细胞化学或免疫荧光的方法鉴定所培养的神经元的纯度。

1.实验对象

胎鼠［孕（18±1）天］、新生鼠（出生24h内）。

2.实验材料

（1）器械：无菌培养瓶、培养皿、离心管、吸头（tip）、手术器械一套（眼科剪、眼科镊、显微镊等）。

（2）试剂：Neurobasal-A 培养基（购自Gibco，货号10888-022）、L-谷氨酰胺（L-Glutamine，购自Gibco，货号25030）、B27无血清添加剂（B27 serum-free supplements，购自Gibco，货号17504-1044）、多聚赖氨酸（Poly-D-lysine，购自SIGMA，货号P-1274）、青霉素/链霉素溶液100×（Penicillin/Streptomycin Solution，购自Hyclone，货号SU30010）、木瓜蛋白酶（Papain，购自Worthington），乙二胺四乙酸（EDTA，100mmol/L，pH 7.2）、溶解木瓜蛋白酶的平衡盐溶液（溶木盐，pH 7.2）［137mmol/L氯化钠+5.3mmol/L氯化钾+1mmol/L氯化镁+25mmol/L葡萄糖+10mmol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）缓冲液+3mmol/L氯化钙］。

（3）试剂配剂

① 培养基（50ml）：Neurobasal-A培养基（49ml）加入B27无血清添加剂（1ml）、青霉素/链霉素溶液（100×，0.25ml）、L-谷氨酰胺（0.5ml）。

② 木瓜蛋白酶溶液：以一只小鼠为例，配制1.5ml溶木盐+25ml 木瓜蛋白酶+30ml 乙二胺四乙酸（EDTA）+少量的DNAase和左旋半胱氨酸，无菌过滤后，于4℃冰箱中备用。

3.操作步骤

（1）包被：培养前晚上用多聚赖氨酸（25μg/ml）铺于培养瓶或培养板，使其完全覆盖底面，置于培养箱至少1h或过夜，用超纯水清洗培养瓶或培养板3遍，置培养箱中待其干燥。

（2）取脑：75%乙醇（酒精）全身消毒胎鼠或新生鼠，断头处死，无菌条件下分层剪开头皮、颅骨，用眼科镊拉开，小心取出全脑，放于盛有冰冷溶木盐的平皿中。

（3）分离海马、皮质：以脑中线为起点，小心拨开大脑颞叶皮质，暴露出新月状海马回，小心夹出海马组织，分离皮质，显微镜下用眼科剪、显微镊分离脑膜、血管膜。

（4）消化和分散：将皮质或海马组织置于装有木瓜蛋白酶溶液的离心管中，37℃培养箱消化20min，每10min晃动1次。吸弃消化液，用完全培养基洗3遍，再加入3～4ml 完全培养基吹打10～15次，静置1min后，用吸头吸取上清液至另一干净的离心管中，再加3～4ml完全培养基吹打、沉淀10～15次，依次吹打，直至沉淀完全分散成单细胞悬液。

（5）计数和接种：混匀所有吹打后的上清液，取少量细胞悬液以台酚蓝染液观察存活率并计数。按1×105/cm2的密度将细胞种入预先包被多聚赖氨酸的培养瓶或培养皿中，置培养箱培养（37℃，5%二氧化碳，饱和湿度）。24h以后换液，之后每3～4天换液一次。

（6）神经元的形态学观察：分散培养的神经元，在接种1h后即可贴壁，细胞呈单个圆形或椭圆形。2～3天后细胞明显增大，突起长出并延伸。6～7天时神经元在相差显微镜下可见具有明显的光晕。此时神经元呈三角形或多边形，边界清晰，胞体明亮，胞核和核仁清晰可见。在培养过程中神经元之间的纤维联系逐渐丰富，并形成网络。随着培养时间的延长，神经元逐渐退化变性，表现为神经元胞体光晕消失，胞体皱缩，突起萎缩，有的出现空泡，直至脱落，造成神经元的数量逐渐减少。

（7）神经元的鉴定：细胞经4%多聚甲醛固定后，β3-微管蛋白（β-Ⅲ-tublin）免疫细胞化学染色，胞浆和轴突着色，4′6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染核可以鉴定。图1-1为典型的神经元染色。

（张　静）