任务一 食品快速检测的特点和分类
食品安全一直是人们重点关注的问题之一。但近年来，食品引发的安全问题时有发生，严重威胁着广大人民群众的身体健康，进而影响经济发展与社会稳定。而目前，我国的食品企业大部分不具有规模性，企业数量多、较分散，从业者法治和自律意识比较薄弱，消费人群和销售渠道较多，导致了食品安全问题频发。从近几年的食品安全问题来看，大部分食品安全问题，除环保和生产条件等客观因素外，大部分源于对农药、兽药和添加剂超范围、超限量使用，以及非法添加剂的使用。要有效解决中国的食品安全问题，就必须对食品的生产、加工、流通和销售等各环节实施全程管理和监控，而目前食品监管部门所采取的采样后送实验室检测流程很难做到及时、快速、全面地从各环节监控食品安全状况，尤其对于生鲜食用农产品等短保质期的食品，这些都需要快速、方便、准确、灵敏的快速检测技术。在一些重大的社会活动如奥运会、世博会等活动中，食品快速检测技术也是一种重要的安全保障手段。
一、食品快速检测的定义
食品安全快速检测并不是一类既定的检测方法，目前也没有严格的定义，普遍从检测时间方面区别于经典检测方法，即包括样品制备在内，能够在短时间内出具检测结果的行为称为快速检测。如微生物检测方法与常规方法相比，能够缩短1/2或1/3时间出具具有判断性意义结果的方法即可视为快速方法。从严格意义上讲，食品安全快速检测是指利用快速检测设施设备（主要包括车、室、仪器、设备等），按照市场监督管理总局或国务院其他有关部门规定的快检方法，对食品（含食用农产品）进行某种特定物质或指标的快速定性定量检测的行为，主要适用于需要在短时间内出具结果的禁限用农兽药、饲料及饮用水中的禁用药物、非法添加剂、生物毒素等的定性检测，检测对象主要为食用农产品、散装食品、餐饮食品、现场制售食品，对于预包装食品原则上以常规实验室检测为主。
食品安全快速检测技术在全程质量控制中起到重要作用，在我国已被广泛用于农业部门、食品安全管理监督部门、农贸市场、超市等开展食品药品质量、安全检测业务和突发性事件（如食物中毒等）的采样检测。2018年12月29日新修正颁布的《中华人民共和国食品安全法》中第一百一十二条“县级以上人民政府食品安全监督管理部门在食品安全监督管理工作中可以采用国家规定的快速检测方法对食品进行抽查检测”。2017年原食药总局出台的《关于规范食品快速检测方法使用管理的意见》指出，各省（区、市）、计划单列市、副省级省会城市食品药品监管部门要按照食品药品监管总局制定发布的《食品快速检测方法评价技术规范》和相应快检方法等要求，通过盲样测试、平行送实验室检测等方式对正在使用和拟采购的快检产品进行评价。评价结果显示不符合国家相应要求的，要立即停止使用或者不得采购。省（区、市）食品药品监管部门可以根据食品安全监管需要，组织专业技术机构对不属于国家规定的食品快检方法开展评价，评价结果符合有关要求的，可用于所在省（区、市）各级食品药品监管部门在食品安全监管中的初步筛查。相关法律法规、政策的实施为食品快检技术的发展指明方向。
二、食品快速检测的特点
食品快速检测能缩短检测时间，以及在样品制备、实验准备、操作过程和自动化上能够实现简单化，对仪器设备等条件的要求不高，能够携带到交易或生产现场实施检测。具体体现在三个方面：一是实验准备过程简单化，使用试剂较少，检测试剂较容易保存且保存期长；二是样品经过简单前处理后就可以进行检测，或采用高效便捷的样品处理方法；三是使用便携型或易用型的试剂盒或小型仪器设备，采用简单准确的分析方法就能对处理好的样品在很短时间内测试出结果，且对操作人员专业知识和技术的要求不高。
食品安全快速检测可以扩大对食品安全不利因素的监测范围，增加食品样品的监测数量，及时发现问题，迅速采取控制措施，必要时将监测到的问题食品送实验室进一步检测，由此达到既可以发挥快速检测的特点，又可以充分利用实验室资源，快速检测方法与常规检测方法彼此互补，形成全方位的食品安全检测技术体系，及时控制、减轻、消除食品突发事故及有毒有害物质对人体潜在的危害，降低食品中毒发生率，提高工作效率。完善的食品安全快速检测体系，可以使食品做到全流程控制，从田间地头到生产，再到运输，最后到销售，从整体上实现食品安全，进而使食品得到了保障，推动食品工业的健康发展。
三、食品快速检测的发展趋势
目前的食品快速检测方法仍具有局限性，需要通过不懈的研究、不断地完善和改进现有的检测技术。食品安全快速检测的发展趋势主要有以下几方面：
①检测灵敏度更高，即最低检出限更低，许多高灵敏度、高分辨率的分析仪器将越来越多地应用于食品快速检测中。
②检测速度将越来越快，企业更加注重生产过程的全面调控，最好能实现在线检测。
③选择性不断提高，各种高新技术的应用，减少出现假阳性和假阴性的机率，使得在复杂混合体中直接进行污染物的选择性测定成为可能。
④检测结果的准确性将越来越高，新技术的应用，提高了用于检测的产品质量，使结果更准确，同时逐渐实现由定性和半定量检测到定量检测。
⑤检测仪器更加智能化、微型化，将逐步实现一次检测可同时测定多种成分的集成化技术，大幅缩短检测周期。
⑥检测成本将越来越低，加快实现快速检测仪器设备的国产化、系统化。
四、食品快速检测的分类
食品安全快速检测按检测场地可分为现场快速检测和实验室快速检测。一般认为，能够在2h内出结果的理化检测方法（包括样品制备在内）即可视为实验室快速检测方法；现场快速检测方法一般在30 min内能够出结果，能够在十几分钟内甚至几分钟内出具结果的即是较好的现场快速检测方法。
现场快速检测着重于利用一切可以利用的手段对检测样品快速定性和半定量；实验室快速检测主要依托于专业的食品检测实验室，着重于利用一切可以利用的仪器设备对检测样品进行快速定性与定量。前者侧重于将一切可以利用的手段从实验室应用于现场检测，主要是利用一些便于携带的仪器设备或试剂盒，在食品快速检测领域已得到较为广泛的应用。而后者则是着重于挖掘现有的设备潜力、更新仪器设备以及改变样品的前处理方式。
目前国内外常用的快速检测方法有化学比色分析法、酶抑制法、生物传感器法、免疫学分析法和生物芯片法等。有些时候是几种方法结合起来进行食品安全的快速检测。
1.化学比色分析法
化学比色分析法是利用迅速产生明显颜色的化学反应检测待测物质，通过与标准比色卡进行目视定性或半定量分析，或在一定波长下与标准品比较吸光度值得到最终结果。目前，常用的化学比色法包括各种检测试剂和试纸，随着检测仪器的不断发展，与其相配套的微型检测仪器也相应出现，如便携式分光光度计。化学比色分析法与一般的仪器分析方法相比，价格便宜，操作相对，结果显示直观，一次性使用，无须检修维护，具有一定的灵敏度和专一性等，非常适用于食品现场快速检测。其不足之处是不能实现无损检测，在检测过程中易受环境条件的影响。化学比色分析技术在有机磷农药、硝酸盐、亚硝酸盐、甲醛、二氧化硫、吊白块、亚硫酸盐等化学有害物质的检测方面已经得到了广泛应用，如图1-1所示。在菌落总数、大肠菌群、霉菌、金黄色葡萄球菌等微生物的检测方面也有不少应用。
图1-1 食品中亚硝酸盐的快速检测
2.酶抑制法
酶抑制法常用于农药及重金属的检测。酶抑制法的原理为农药、重金属等可以抑制相应的酶的活性，从而使底物一酶体系产生一系列变化。农药残留检测使用的酶主要是动物胆碱酯酶，其中有机磷及氨基甲酸酯类农药的磷脂键、酰胺键与酶活性中心的丝氨酸键合，使酶失去活性。农残速测卡的检测原理是有机磷或氨基甲酸酯类农药能抑制胆碱酯酶催化靛酚乙酸醋（红色）水解为乙酸与靛酚（蓝色），从而判断出样品中是否含有高剂量有机磷或氨基甲酸醋类农药，如图1-2所示。重金属检测使用最多的是脲酶，除了脲酶以外，其他酶如葡萄糖氧化酶、磷酸酯酶、过氧化物酶、蛋白酶等也被越来越多地应用到重金属的检测中，重金属离子能与形成酶活性中心的巯基或甲巯基键合而抑制酶的活性。酶抑制分析法的应用范围较广，但也存在着各种问题，例如，此分析方法对于一些残留有农药的果蔬很容易产生假阳性反应，直接影响到最终的检查结果，采用该方法发现超标现象时，必须用标准方法进行复测确证，这在《农产品质量安全法》第三十六条第二款中有明确的规定。对于阴性结果，也应按比例进行抽样，采用可靠的方法进行复测确证。
图1-2 果蔬农药残留速测卡的检测结果判定
3.生物传感器法
生物传感器是通过被测定分子与固定在生物接收器上的敏感材料发生特异性结合，并发生生物化学反应，产生热焓变化、离子强度变化、pH变化、颜色变化或质量变化等信号，且反应产生的信号的强弱在一定条件下与特异性结合的待测物浓度存在一定的数量关系，这些信号经传导器转变成电信号后被放大测定，从而间接测定待测物浓度。与传统的化学传感器和离线分析技术相比，生物传感器有着许多不可比拟的优势，如高选择性、高灵敏度、较好的稳定性、低成本、可微型化、便于携带、可以现场检测等，它作为一种新的检测手段正在迅猛发展。在食品安全现场快速检测领域，各种新技术如纳米技术、分子印迹技术等为其提供了丰富的发展空间。生物传感器在食品分析中的应用包括食品成分、食品添加剂、有毒及食品鲜度等的测定分析。
（1）食品成分分析
在食品工业中，葡萄糖的含量是衡量水果成熟度和储存寿命的一个重要指标。已开发的酶电极型生物传感器可用来分析白酒、苹果汁、果酱和蜂蜜中的葡萄糖。其他糖类（如果糖、麦汁中的麦芽糖）也有成熟的测定传感器。
（2）食品添加剂分析
亚硫酸盐通常用作食品工业的漂白剂和防腐剂，采用亚硫酸盐氧化酶为敏感材料制成的电流型二氧化硫酶电极可用于测定食品中的亚硫酸盐含量，测定的线性范围为0～0.6 mmol/L。又如饮料、布丁等食品中的甜味素，有报道表明：科学家采用天冬氨酶结合氨电极测定，线性范围为2×10-5～1×10-3mol/L。此外，也有用生物传感器测定色素和乳化剂的报道。
（3）农药残留量分析
一种使用人造酶测定有机磷杀虫剂的电流式生物传感器已经面世，它利用有机磷杀虫剂水解酶，对硝基酚和二乙基酚的测定极限为10-7mol/L，在40℃下测定只要4 min。另一种采用戊二醛交联法将乙酰胆碱酯酶固定在铜丝碳糊电极表面，制成可检测浓度为10-10mol/L的对氧磷和10-11mol/L的克百威的生物传感器，可用于直接检测自来水和果汁样品中这两种农药的残留量。
（4）微生物和毒素的检测
食品中病原性微生物及其产生的毒素的存在会给消费者的健康带来极大的危害，食用牛肉很容易被致病性大肠杆菌0157：H7所感染，因此需要快速灵敏的方法检测大肠杆菌0157：H7一类的细菌。光纤生物传感器可以在几分钟内检测出食品中的大肠杆菌0157：H7。这种生物传感器从检测出病原体到从样品中重新获得病原体并使它在培养基上独立生长总共只需1天时间，而传统方法需要4天时间。
4.免疫学分析法
免疫学分析法检测的基本原理是以医学的血清学检测方法为基础，通过抗原与抗体的高度专一性特异反应进行检测。抗原抗体反应是一种非共价键特异性吸附反应，一般情况下，抗原只和它自己诱导产生的抗体发生反应。
（1）酶联免疫法（ELISA）
ELISA检测法的基础是抗原或抗体的固相化以及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性，抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物发生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体，也可以是抗原。ELISA检测方法将抗原抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用结合起来，具有特异性强、灵敏度高的特点，是目前应用最广泛的食品安全快速检测方法之一。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法可有多种，比较常用的是ELISA双抗体夹心法和ELISA间接法。
ELISA双抗体夹心法基本原理是，受检样品（测定其中的抗原或抗体）与固相载体（酶标板）表面的抗体或抗原起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，通过反应也结合在固相载体上。然后加入能与酶反应的底物后，底物被酶催化成有色产物，产物的量与样品中受检物质的量直接相关，故根据呈色的深浅进行定性或定量分析，如图1-3所示。酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
图1-3 ELISA双抗体夹心法
在测定时，通常选择能识别同一待测物质（视为抗原）的不同抗原表位的抗体对（两个单抗），其中一抗体作为捕获抗体包被在酶标板上，与标准品及待测物质结合。另一个抗体标记生物素作为检测抗体，与结合在第一抗体上的待测物结合。然后再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素，亲和素与检测抗体标记的生物素结合。加入显色剂后，标记在亲和素上的HRP使无色的显色剂变蓝，加入终止液变黄，在450 nm处测吸光值。待测样本中的细胞因子浓度与吸光值呈正相关。
ELISA间接法是检测抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体上，加入待测物质（抗体）与之结合，洗涤后，加酶标抗体和底物进行测定，如图1-4所示。
图1-4 ELISA间接法
目前ELISA试剂盒已得到广泛应用，国家市场监督管理总局推荐ELISA试剂盒作为动物激素和抗生素残留的首选筛选试剂。ELISA试剂盒已用于盐酸克伦特罗（CLB）的检测，其优点是灵敏度高、操作简便、检测迅速且价格便宜，缺点是仍不能实现现场检测并且假阳性率较高。
（2）免疫胶体金法
免疫胶体金法又称胶体金试纸法、Rosa法，是以胶体金为显色媒介，利用免疫学中抗原抗体能够特异性结合原理，在层析过程中完成这一反应，从而达到检测的目的，具有简便、特异、快速、敏感的特点，且不依赖于专业技术人员及昂贵的仪器设备。
图1-5 胶体金标准试纸条的结构
目前比较常用的胶体金标准试纸条由样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素（NC）膜及吸水纸等材料依附在有一定硬度的支架上，如图1-5所示。对样品进行检测时，在吸水纸的吸引作用及毛细管作用下，液体样品依次通过样品垫、胶体金垫、NC膜，到达吸水纸端。NC膜上固化有两道线：检测线T和质控线C。质控线显色指示测试有效，检测线则根据检测模式的不同而呈现红色或不显色，以指示阳性或阴性结果。胶体金免疫检测区分为快速检测卡和快速检测试纸条两种形式，其中，快速检测试纸条常见3.5mm宽的窄条和5.0mm宽的宽条。
免疫层析试纸的检测原理主要有两种：夹心法和竞争法。利用夹心法检测时，胶体金标记的抗体或抗原与相应的被检测物结合后，可以被检测线上的另外一株抗体拦截显色，同时多余的金标抗体或金标抗原被质控线上的抗体拦截显色。若样品中不含被检测物，则不能与金标抗体或金标抗原结合，不被检测线拦截显色，而质控线上的抗体则与金标抗体或抗原结合显色。即阴性样品仅有质控线显色，检测线不显色；阳性样品在检测线和质控线同时显色，如图1-6所示。
图1-6 双抗体夹心法检测原理
利用竞争法检测时，当样品中的被检测物与金标抗体结合后，就能阻断金标抗体与检测线上的固化物结合，此时胶体金颗粒不在检测线上聚集，也就不显色，多余的金标抗体与质控线上的抗体结合，使胶体金颗粒聚集显色。而如果样品中不含有被检测物，那么也就不能阻断金标抗体与检测线上的固化物结合，此时检测线上将发生胶体金的聚集显色，同样，质控线也因胶体金颗粒的聚集而显色。即检测阴性样品时，结果同时出现检测线和质控线显色；检测阳性样品时，仅出现质控线显色，不出现检测线，与夹心法的结果判定恰恰相反，如图1-7所示。
图1-7 竞争法检测原理
免疫胶体金法在肉眼条件下即可对结果进行快速判读，一般应用于现场的初步筛查。该方法常用于检测有害微生物、农药残留、兽药残留、转基因食品及食品中非法添加物如三聚氰胺、猪肉中瘦肉精等的检测。该方法可在10 min内快速检测牛奶中的抗生素，利用该技术可检测的抗生素种类有5种，包括内酰胺、四环素、磺胺二甲嘧啶、恩诺沙星和黄曲霉毒素，可检测的内酰胺药物有氨苄西林、阿莫西林、氯唑西林、头孢噻呋、头孢霉素和青霉素G等。表1-1列举了免疫胶体金法在食品分析中的部分应用。
表1-1 免疫胶体金法在食品分析中的部分应用
5.生物芯片法
生物芯片就是利用原位合成或微距阵点样等方法，将大量基因片段、基因探针、抗原抗体、多肽分子或细胞等生物大分子有序地固定在硅胶片、玻璃片或高分子聚合物薄片等支撑物的表面，形成密集的二维分子排列，然后与已标记待测生物样品中的靶分子杂交，通过精密的扫描光学仪器来采集数据，并借助计算机软件对数据进行分析，最后判断出样品中靶分子的种类和数量。
生物芯片的发展历史较短，但所包含的种类却很多。到目前为止，其分类方式和种类尚没有完全统一的标准。根据用途分类可以分为电子芯片和分析芯片；根据作用方式分类可以分为主动式芯片和被动式芯片；根据构造不同可以分为阵列型芯片、微流控芯片和纳米芯片等；按照成分分类，又可分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片和芯片实验室等，按照成分分类是目前最常见的一种分类方式。生物芯片的种类繁多，每一种芯片都有它们各自的独特之处。与传统的分析方法相比，生物芯片具有明显的优势，1个生物芯片就可以同时实现多个分析样品的检测，且分析检测时使用较少试剂即可得出结果，具有高通量、高精密度的优点。
（1）免疫芯片
免疫芯片是一种特殊的蛋白芯片，芯片上的探针蛋白可根据研究目的选用抗体、抗原、受体等具有生物活性的蛋白质。芯片上的探针点阵，通过特异性免疫反应捕获样品中的靶蛋白，然后通过专用激光扫描系统和软件进行图像扫描、分析、结果解释，具有高通量、自动化、灵敏度高和多元分析等优点。由于单克隆抗体具有高度的特异性和亲和性，因此是比较好的一种探针蛋白，用其构筑的芯片可用于检测蛋白质表达丰度及确定新的蛋白质。
在免疫芯片的制作过程中，关键的步骤是抗原或抗体的固定。根据固定原理可分为物理吸附法和共价结合法。物理吸附法简便易行，但是固定的抗原分子数少，在以后的洗涤过程中，固定分子容易脱落，影响结果的判读。近年来，免疫芯片的研制中多采用共价结合法进行抗原或抗体的固定，常用的材料包括玻璃片、硅片、金片、聚丙烯酰胺凝胶膜、尼龙膜等。在众多的共价固定材料中，通常采用的是玻璃片及聚丙烯酰胺凝胶膜。采用聚丙烯酰胺凝胶膜固定抗原或抗体过程是通过光致聚合作用在玻璃片上制备众多的彼此分开的聚丙烯酰胺凝胶膜，然后用戊二醛进行膜的活化，活化膜上的醛基和抗原或抗体中的氨基反应形成酰胺键，从而完成识别分子的固定，其优点是固定的识别分子数量大，在其上进行的抗原抗体反应近似于液相中的反应，反应速度快，信号强。
在免疫芯片中常用的标记物有放射性同位素、酶、荧光物质等，依据标记物的不同采用不同的检测方法。采用酶及荧光物质标记抗原或抗体具有敏感、简便、快速的优点，这两种标记方法克服了放射性同位素标记法存在放射性污染的不足，已成为免疫芯片中常用的标记物，抗原与抗体反应结束后用扫描仪进行荧光信号的检测。对于小分子的免疫芯片检测，由于小分子多数不具备两个以上供抗体结合的位点，不能用双抗夹心法进行测定。因此，在芯片上对小分子的检测均采用竞争法。即分别对其进行化学衍生并使之与大分子蛋白偶联合成各自的蛋白结合物，然后通过对蛋白的标记而间接标记小分子，检测时利用非标记小分子对检测液中偶联物产生的竞争强度来确定待测液中小分子的含量。免疫芯片在食品快速检测中的部分应用见表1-2。
表1-2 免疫芯片在食品快速检测中的部分应用
（2）基因芯片
基因芯片，又称DNA微陈列，是指按照预定位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子所组成的微点阵阵列。在一定条件下，载体上的核酸分子可以与来自样品的序列互补的核酸片段杂交。如果把样品中的核酸片段进行标记，在专门的芯片阅读仪器上就可以检测到杂交信号。基因芯片检测方法由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析。它解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。基因芯片以其可同时、快速、准确地分析数以千计的基因组信息的本领而显示出巨大的威力。这些应用主要包括基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析、基因文库作图和杂交测序等方面，在食源性致病菌和病毒的快速检测中也得到了初步应用。
（3）液相悬浮芯片
Luminex悬浮芯片是美国Luminex公司开发的一种多功能的液相芯片分析平台，也称xMAP、MASA（多功能悬浮点阵仪）或液体芯片。它集中了分子生物学、免疫学、高分子化学、激光物理学、微流体学、计算机科学等多门学科，使悬浮芯片法的检测特异性和灵敏度得到了前所未有的发展。它可以在一个25～50 μL的样品内同时检测100种以上不同的检测项目，具有重复性与稳定性好、高通量、检测指标可灵活选择、高灵敏度与高信噪比等诸多优点。与传统的固相芯片相比，它克服了固相芯片在大分子检测时表面张力、空间效应等对反应动力学的干扰。优化实验条件后，近似完全液相的反应体系对特异性生物学反应的影响几乎可以忽略，检测结果的稳定性和重复性也因此得到很大的提高。Lummex的多参数高通量分析具有节约试剂和样本、操作简单等多种优势，被越来越多的科研和临床工作者所接受。