聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）的建立使核酸序列得以首次在体外扩增，因而大大地缩短了DNA扩增的时间，简化了步骤，节约了费用。这种技术一出现就很快被应用于核酸序列扩增，基因诊断，克隆和测序等分子生物学实验，从而使基因工程技术发生了革命性变化。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖，现已成为许多实验室分子生物实验的常规方法。聚合酶链式反应是扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的一种方法。首先合成一对寡核苷酸引物（约20个核苷酸左右），该两条引物分别与模板DNA两条链上的各一段序列互补，而这两段模板序列又分别位于待扩增DNA区段的两侧。然后在一定的条件下先将模板DNA和引物一起加热变性，在随后的降温复性过程中，两条引物会分别与模板DNA两条链以互补碱基序列退火配对。在有4种dNTP和DNA聚合酶存在下，退火引物会沿模板链延伸。如此反复进行变性、退火和DNA合成一个循环，由于一轮扩增的产物又充当下一轮的模板，所以在这一周而复始的过程中每完成一个循环，就基本上使DNA产物增加一倍，经过30～40个循环，极少量的基因甚至一个分子的DNA，可以扩增至10 ⁶以上，可见其敏感性很高。较之传统的其他方法，PCR具有两个显著的特点：高敏感性和节省时间。

PCR反应系统的组成及其注意事项：

用作引物的寡核苷酸长度最好在20～24个核苷酸，两个引物之间的距离正好是PCR扩增片段的长度。引物一般长20～27mer，其有效长度不能大于38［有效长度可依此式计算：Ln=2（G+C）+（A+T）］。引物的碱基组成中G+C以40%～60%为好，T _m值应介于55～80℃，接近72℃为佳［T _m=4（G+C）+2（A+T）］，引物内碱基要随机分布，不能形成发夹结构或二级结构，引物间不能互补。引物3′端不能进行任何修饰，而5′端可加入酶切位点，用生物素和其他物质标记，引入突变位点等。

通用的引物命名规则为：G（O）-（I-L）R（C）-SD。其中：G=基因缩写；O=生物来源；I=非互补5′碱基标识符；L=非互补碱基长度；R=基因的区域；C=5′互补碱基的位置；S=寡核苷酸的总的大小；D=寡核苷酸的5′→3′方向。基因区域（R）缩写为5′时，为基因上游区，缩写为E时，后面有外显子数字，缩写为I时，后面有内含子数字，缩写为3′时，为基因的下游区。寡核苷酸的方向或为U（上游）或为D（下游）。如果一转录物已定性，则D为正义方向，U为反义方向。目前已有许多用于引物辅助设计的计算机软件。

PCR可以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增。以RNA为模板进行扩增时，须先行反转录成cDNA。模板可来自任何组织、细胞和体液。PCR时其需要量为10 ²～10 ⁵拷贝靶序列。

现在使用的 Taq酶是栖热菌属细菌（ Thermus aquaticus）中的DNA聚合酶，其分子量为94kDa。该酶同时具有反转录酶活性和聚合酶活性，其聚合活性的比活性为：150个核苷酸·S ^-1·酶分子 ^-1。 Taq酶有5′→3′外切活性而无3′→5′外切活性，故 Taq酶缺乏校对功能，每一循环移码突变率为1/30 000，碱基替换率为1/8 000。许多因素如PCR温度、镁离子、DMSO、DMF和尿素等都会不同程度地对酶的活性产生影响。

典型PCR反应由三部分组成：①变性：一般可采用95℃×30s；②复性：复性温度取决于引物的碱基组成、长度和浓度。最适复性温度值应在有效启动温度2～5℃，可依下两式计算。Tp（有效启动温度）=22+1.46（Ln），Ln（有效引物长度）=2（G+C）+（A+T）。③延伸：多选用72℃，现在有一些新的DNA聚合酶可以在较低温度，比如68℃。PCR的循环数一般多选用25～50个循环。

dNTP终浓度20～200μmol/L，应注意其中ATP的质量。在PCR中加入石蜡油可防止液体蒸发。在反应体系中加入一定的促进剂，如DMSO和氯化四甲基铵等可有助于获得较好的效果。

标本交叉、实验室中克隆质粒的污染和PCR产物的污染是PCR过程中最常见的污染来源，应该给予认真地注意。可采用隔离不同操作区、分装试剂和改进实验操作等方法予以克服。

一般可选用下列方法之一或几种联合对PCR产物进行分析：电泳分析、寡核苷酸探针杂交、PCRSSCP或PCRRFLP、序列分析等。前者简单易行，后者具有决定意义。

PCR技术建立以后，许多学者为了使这一技术更加完善，更加适应不同领域不同目的的实验，进行了不少改进与改良，以下列举一些在分子流行病学研究中较为常用的方法。

实时定量PCR（real-time PCR）是在PCR扩增过程中，通过荧光信号对PCR进程进行实时检测。其原理是将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，进行常规PCR循环。循环过程中，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。其中几个相关名词的含义为：

每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。

PCR反应时前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省（默认）设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10×SDcycle 3～15

每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式如下。Ct=-1/lg（1+Ex）×lgX0+lgN/lg（1+Ex）

n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。

起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

荧光探针和荧光染料。TaqMan荧光探针寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时， Taq酶的5′→3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。SYBR荧光染料会以非特异性方式掺入DNA双链后发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。分子信标是一种在5′和3′末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。

该方法已经被广泛应用于多种实验和临床检验中。例如，为了研究肠道微生物群与代谢之间的联系及其在糖尿病发病过程中的作用，Kim-Anne Le等采用实时定量PCR方法测量2型糖尿病患者（T2D）肠道共生细菌双歧杆菌和乳杆菌属共16种菌群。通过口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和HbA1c测定确定T2D和对照受试者。通过实时定量PCR测量粪便中的双歧杆菌和乳酸杆菌属。结果发现，与对照组比较，T2D患者总乳酸杆菌总数（+18%）， L. bugaricus（+13%）， L. rhamnosum（+37%）和L.acidophilus（+48%）（ P<0.05）显著升高，而总双歧杆菌（−7%）和 B. adolescentis（−12%）的总量较少（ P<0.05）。聚类分析显示，T2D患者肠道微生物存在多的乳杆菌和较少的双歧杆菌。

定量PCR有多种形式，最可靠的PCR定量法是竞争PCR。它是指在同一管中同时扩增两个不同的模板，即竞争模板和检测模板，其中加入的竞争模板量是已知的，两模板的长度相近，有相同的引物识别序列，因此保证了完全相同的热力学和扩增效率，两模板的扩增产物可通过凝胶电泳分析清楚地区分开来，再通过光密度来检测两条带的相对强度。

按照PCR的扩增原理，产物量可由公式Y=Y′（1+e）n算出，式中Y为终产物量，Y′为起始模板的拷贝数，e为扩增效率，n为循环数。在竞争PCR中，两模板产量的函数关系分别为：竞争DNA=C+Ci（1+e）n，野生型DNA=W+Wi（1+e）n，由于e和n对两模板来说完全相等，相对的产物比值（C/W）直接与起始模板浓度相关，可由下式表示：C/W=Ci（1+e）n/Wi（1+e）n=Ci/Wi。Arnold等根据竞争性PCR的原理，对HIV-1 DNA进行了定量分析，它们将一个67bp的质粒DNA插入靶DNA中，得到的外标准模板与待检标本一同行PCR，可得到长度分别为200bp和267bp的扩增产物，再用Ambis放射分析图像系统定量。结果表明，外标准模板的起始浓度在靶基因起始浓度50倍范围内，两者扩增是成比例的。由于通过分子克隆而得到竞争模板的方法复杂烦琐，Diviacco等采用了重组PCR技术。除合成一对20bp的外引物外，还合成了一对40bp的内引物，上下引物的3′端碱基顺序分别与临近待扩增的上下基因组链相同，而5′端的20个核苷酸则完全互补。PCR分两阶段进行，第一阶段分别由外上引物与内下引物和外下引物与内上引物配对作为反应体系中的引物，第二阶段将两种扩增产物混合，通过变性-复性溶合在一起，重叠部分又可相互作为引物，进行PCR反应延伸，这样便可得到大量的比待测模板多20bp的竞争模板。两模板在同一管内经PCR共同扩增，产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再电泳洗脱回收，由β计数器测其放射活性，根据二者的比值来推算待测标本中的DNA量。依据同样的原理，以缺失法得到比待测模板少207bp的竞争模板，用倍比稀释的靶基因与固定的竞争模板一同进行PCR，以输入的靶模板量的对数为横坐标，由数字图像处理系统测得的两种产物的比值的对数为纵坐标建立标准曲线，并得出Y=-1.229+0.606x的函数关系式，据此可算出标本中的核酸含量。

竞争性PCR曾被用于丙型肝炎病毒（HCV）的检测。首先用基因工程制成HCV的RNA模板，此模板和天然HCV RNA不一样，序列中有人为突变加入的 EcoRⅠ酶切位点。用已知浓度的人工HCV RNA模板和从血清中提取的天然HCV RNA加入同一管内进行反转录和扩增。人工HCV RNA和天然HCV RNA均得到扩增后再用 EcoRⅠ消化。由于人工HCV RNA分子可被切断，而天然HCV RNA无改变，这样可从电泳结果中观察到其各自的PCR扩增带，并用密度扫描仪测量两种扩增产物的电泳密度。鉴于人工HCV RNA的量是已知的，因此可计算出天然HCV RNA的含量。Hagiwara等测定了104例HCV携带者，发现血清HCV RNA为10 ⁴～10 ⁹基因组/ml，随着病情的加重，HCV RNA的滴度逐渐增加。

有些抗原在体内的数量甚微，因此很难用目前检测抗原的检测手段检测到，而PCR方法可直接检测病原体核酸的存在，如何将这两种方法结合起来达到对微量抗原或抗体的检测呢？分子生物学家把检测抗原抗体的酶联免疫检测方法和PCR结合起来，发展了新的抗原抗体检测系统，即免疫PCR。

Takeshi Sano等选用较容易获得纯化的蛋白质和单克隆抗体的小牛血清白蛋白（BSA）作为抗原，固定在酶联微孔板上。随后的检测程序和一般的酶联免疫很相似，所不同的是，在传统的ELISA中，用酶标记的第二抗体直接和第一抗体结合，而免疫PCR则用与生物素标记的质粒DNA（pUC19）结合的链霉素蛋白抗生物素-蛋白A融合蛋白，然后用适当的引物，把结合的标记DNA经PCR扩增，并经琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。PCR扩增产物分析显示，由非特异性结合的抗体或融合蛋白——pUC19所产生的背景PCR量是很低的，而阳性PCR则可很清楚地从背景PCR中辨认出来。这说明，PCR扩增的特异性能够避免微孔板中的其他DNA分子引起的假信息。由于标记用的DNA顺序和它的扩增产物是完全任意的，因此，根据需要可以经常变换标记用的DNA来防止假信息的出现。他们用此方法可清楚地检测少到只有580个抗原分子（BSA）。比用辣根过氧化物酶的酶联检测方法的灵敏度高5～10倍，比放射免疫分析的灵敏度也大几个数量级。乙型肝炎病毒（HBV）基因的翻译可能发生在很低水平，因此这些低水平病毒携带者血清和肝组织内的HBsAg含量低于目前免疫学检测到的极限。美国波士顿MGH癌症研究中心的Maia等用改进的免疫PCR检测到血清内亚pg（sub-picogram）水平存在的HBsAg。这比传统方法提高了10 ²～10 ³倍。这样不仅对识别隐性传染源，而且对组织内HBV的低水平复制的研究也具有实用价值。

原位PCR是1990年由Hasse等首先建立，他在测定感染绵羊脉络丛细胞的绵羊髓鞘脱落病毒（Visna）时，首先用多重寡核苷酸引物扩增脉络丛细胞中Visna病毒 gag基因的1 200bp的DNA片段，然后用150bp的寡核苷酸探针对细胞中扩增的DNA片段进行原位杂交。结果表明，原位PCR的敏感性至少比原位杂交的敏感性高几个数量级，可测及一个拷贝的 gag基因。随后，Nuovo等进一步改进了原位PCR技术，并用于检测用甲醛固定和石蜡包埋的组织样本中不同类型的人乳头状瘤病毒。原位PCR的主要步骤如下：为了使组织切片在实验中附着于玻璃片，先用多聚四氟乙烯对玻璃片进行预处理；将组织切片或细胞加在玻璃片上并风干；采用多聚甲醛，过氧化氢和蛋白酶K等处理玻片；加入PCR试剂和设定PCR条件进行PCR；最后用寡核苷酸探针进行原位杂交。PCR扩增的长度对原位PCR有一定影响，理想的扩增长度为1 200～1 500bp。为了充分暴露模板，实验中经常用蛋白酶K处理切片。一般认为经甲醛固定的组织切片需用蛋白酶K消化，以缓解固定后核酸-核酸、核酸-蛋白质之间过多的交联。而对培养的细胞，多不需蛋白酶K的消化，以免通透性太大，扩增产物扩散出细胞。至于蛋白酶K的浓度和消化时间，则依组织来源不同而做不同选择。

原位PCR不但可用于对靶基因的扩增，更重要的是它可用于确定组织中阳性细胞的细胞类型和携带靶序列的细胞的百分比。例如，在细胞培养中，HIV-1病毒可感染CD4 ⁺、CD8 ⁺淋巴细胞、B淋巴细胞、纤维细胞和神经胶质细胞。然而，CD4 ⁺淋巴细胞可能作为血流中HIV-1最初的宿主单核巨噬细胞则可能是组织中最重要的宿主细胞，这就需要原位PCR这一精确技术来高度识别体内携带病毒的所有细胞类型及允许HIV-1活跃复制的细胞。Bagasra等应用原位PCR技术研究了HIV-1感染者在潜伏期及复制活跃期HIV-1感染PBMC的总数，研究发现，在13例患持续性全身性淋巴结肿大的患者单核细胞中，平均6.6%受感染，19例艾滋病患者单核细胞受HIV-1感染的百分比为4.6%，5例卡波济氏肉瘤的患者中，单核细胞感染率平均为1.6%，而19例无症状的HIV-1感染人群中，单核细胞感染率平均仅为0.9%。原位PCR可作为分析疾病之间因果关系的一种手段。AIDS患者并发恶性淋巴瘤的概率是非AIDS患者的200倍。有学者认为，这可能与HIV感染激活的、表达有CD4抗原的B淋巴细胞有关。Prevot使用原位PCR后发现，在肿瘤组织中只有HIV的RNA而无DNA序列存在，而且阳性标记物的分布规律与RNA的合成规律一致，有时标记物还可聚集于细胞一端。他认为，这种分布状况说明HIV在淋巴瘤的发生中没有发挥直接病理作用，而AIDS并发淋巴瘤的原因，更可能与HIV引起免疫缺陷有关。

原位杂交PCR中还存在一些问题，如有时会出现假阳性或假阴性结果，假阳性多由扩增产物在细胞内扩散引起，而假阴性则与扩增产物的丢失有关。原位PCR与原位杂交相比，能将其灵敏度提高50～100倍，但与液相PCR相比，其扩增倍数又低得多。这可能与PCR反应混合液在玻片上分布不均、靶DNA暴露不理想等原因有关。此外，原位PCR对标本处理要求较高，与液相PCR相比，操作更烦琐。

PCR中反应物及其浓度的变化会对反应产物的特异性和产量产生影响，因此，在改变热循环条件和形成新的方法前，必须对参与反应的各种反应物浓度进行不同的组合，通过大量的实验，才能找到最佳实验条件。将在工业实验中应用的Taguchi法改良后用于PCR，有助于在寻找最佳条件时减少试验次数。例如，检验4种各有3个不同浓度水平的反应物（即4因素3水平）的最佳组合时通常的方法需81次试验才能完成。根据Taguchi法的公式E=2K+1（E为试验次数，K为反应物数）却只进行9次试验。如果计算结果次数为3的倍数，则将之校正为下一个3的倍数值。随着受检反应物数的增加。所需试验次数的减少更为明显。如果对于9因素3水平需要19 683次才能分析完的试验，运用Taguchi法时则降至21次（2×9+1=19，下一个3的倍数为21）。改良Taguchi法中将可能影响结果的因素按正交排列来安排试验，以保证每个反应物的各个浓度的单独作用能得到确定。每一个反应物的浓度预先设计，并且有明显的区别。理论上PCR的目的是使产物的产量尽可能地提高，故可应用产物的产量估计各反应物对于扩增的作用。可计算扩增效应信（号）/噪声比SNL, n为反应物的浓度水平数，y为产物的产量。经计算得到每一反应物不同浓度相对应的SNL值，以反应物浓度作为自变量，SNL值作因变量Y，代入回归方程：Y=mX ²+nX+c，求解系数后，绘制函数曲线，其中最大值所对应的浓度值即为该反应物的最佳反应条件。

根据此原理，在对昆虫病原体真菌（ Metarhizium anisopliae）中一段编码化学弹性蛋白酶（chemoelastase）prl的基因（约700bp）作PCR扩增时，进行优化试验。25μl反应中含10mmol Tris-HCl（pH 8.3），50mmol KCl及0.5U的 Taq DNA聚合酶。3个引物水平4个受检反应物浓度，共进行9次不同浓度反应物组合的实验，同一试验重复三次。将PCR产物电泳后照像，用NIH图像扫描仪分析，得到凝胶上各产物密度图形，计算相对峰面积，以其代表prl片段扩增的产物量。代入上述公式通过计算，作出回归曲线。根据回归曲线得出的最佳反应条件分别是：7.5pmol引物，4ng DNA模板，2.5mol/L MgCl ₂及0.05mol/L dNTP，与既往惯用的50pmol引物，20ng DNA模板，1.5mol/L MgCl ₂及0.1mol/L dNTP相比，扩增产物特异性强，产量高。另外，亦证明过高的Mg ²⁺浓度可促使非特异产物扩增。总之，此法减少了试验次数（从81到9次），提高了反应的特异性和扩增产量。