DNA在热变性后两条链可以打开，此时若与具有同源序列的核苷酸片段一同退火，则DNA分子和寡核苷酸片段可通过碱基相互配对，称为分子杂交（molecular hybridization）。RNA分子也能与互补的核苷酸序列结合。这种核苷酸片段称为核酸探针（probe）。核酸分子杂交技术高度特异，可广泛用于对待测DNA或RNA进行定性和半定量分析。核酸杂交的方法种类繁多，如斑点杂交，Southern杂交，Northern杂交等。该法既能检测提取的核酸，也可用于原位杂交。

核酸杂交可检测DNA和RNA分子。目前从细胞和病原体中提取核酸的方法很多。杂交用DNA的制备要求较为简单，多在SDS或蛋白酶处理细胞后，用酚和氯仿等除去变性蛋白质，再用RNA酶消化其中的RNA后即可使用；RNA的制备较为复杂，主要是防止无处不在的RNA酶对RNA的降解，目前多使用高浓度的硫氰酸胍或先用适量蛋白酶处理使细胞或病原体裂解，再用酚和氯仿除去变性蛋白。高浓度的硫酸胍和β-巯基乙醇等能抑制RNA酶的活性，商品化的RNasin也能大大地提高RNA制备的产量和质量。在病理标本中大多采用原位杂交，可直接选用经特定甲醛固定的石蜡包埋标本。在检测一些含量较少的靶核酸时，可采用PCR等对靶基因予以放大，提高检测灵敏度。

按其结构目前探针可分为DNA和RNA两类，应根据实验要求选择适当的探针。DNA有单、双链及合成的寡核苷酸探针，RNA探针可从克隆载体上借助SP6等启动子以体外转录方式生成；按其方向可分为正义和反义探针两种。

探针的标记可使用放射性核素，如 ¹²⁵I、 ³⁵S、 ³²P和 ³H等，多有商品出售，核素法灵敏度高，但场地和安全防护要求高。目前非放射性标记被越来越多的人采用，如生物素类（长臂生物素BNHS、光敏生物素PAB、生物素酰肼等）、地高辛（Dig）、化学发光法（吖啶酯acridinium esters, AE）等。

探针标记法有多种，常用的有：①缺口平移法（nick translation：以极低量的DNase Ⅰ在待标记的双股DNA每条链上随机产生若干缺口，再借助DNA聚合酶的5′→3′外切酶活性以及多聚酶活性，在缺口处5′端每切除一个核苷酸则在3′端添加一个已标记的脱氧核苷酸（α ³²P-dATP、bio-7-dATP或bio-11-dUTP）以修补缺口，随着缺口在DNA链上的平移，标记核苷酸就掺入到新合成的DNA链上。此法的标记强度为每千核苷酸掺入10～30个标记核苷酸。缺口平移法不适用于单链DNA，但可用于线性或环状双链DNA。缺口的数目和最终标记产物的长度取决于DNaseⅠ的浓度。推荐标记核苷酸的长度是200～500bp，它最适合于滤膜杂交反应。在标记反应的数小时内，放射性标记的掺入和标记时间成正比。②随机引物法：以六聚寡核苷酸为引物，待标记的DNA为模板，加入标记核苷酸和其他三种核苷酸底物，在DNA聚合酶Klenow片段催化下作引物延伸反应，即可将标记核苷酸掺入到核酸探针中。此法掺入量高，可用于各种杂交。核素法标记的探针长度400～600个核苷酸， ³²P标记物较易降解，即使仅贮存24h，探针的平均长度会显著降低。可用生物素或地高辛的标记从低溶点琼脂糖中回收的DNA片段，每条新合成链中可掺入20～25个标记核苷酸，在检测时会有足够高的敏感性。标记DNA的长度取决于模板，可从200～2 000bp不等。③PCR标记法：PCR方法在体外可获得大量的探针，其长度可自180～2 000bp不等，核素的活性可达到5×10 ⁹cpm/μg。相比较而言，缺口平移的活性约为0.5×10 ⁹cpm/μg，且在片段小于1kb时标记率大大降低，随机引物法的标记活性为2×10 ⁹cpm/μg，在标记长度超出0.2～2 000时标记率下降。PCR法尤适用于500bp以下的探针标记。放射性强度可通过调节“冷”（未标记dNTP）和“热”（标记dNTP）的比例进行调整。④末端标记法：可利用DNA末端转移酶将标记核苷酸（γ ³²P-dATP、bio-dATP）直接加到寡核苷酸的3′末端上。⑤体外转录法：在有标记核苷酸底物存在下，利用特定的启动子引物和RNA聚合酶（如SP6 RNA聚合酶等）体外进行RNA聚合，即可得到RNA探针。选择不同的启动子可分别制备出正义或反义RNA探针。RNA探针较之双链DNA探针有许多优点：探针之间不会竞争结合，标记活性高（1×10 ⁹cpm/μg），易确定长度，可采用RNA酶消化未杂交探针显著降低本底等。除滤膜和原位杂交外，一些特殊的实验也使用RNA探针，如RNase图谱分析，体外翻译，反义RNA特异阻断某些基因的表达等。此外还有许多新的标记方法不断出现。

常用的核酸杂交方法有两种类型：直接将核酸溶液点到滤膜上的点或狭带的杂交法；先经琼脂糖电泳把核酸分带，然后将其转移到滤膜上的Southern杂交或Northern杂交法。在进行Southern杂交时，先需用限制性内切酶对DNA适度消化，再加样进行琼脂糖凝胶电泳，采用高浓度的离子盐（20×SSC）将DNA带转移到硝酸纤维素膜上。对于天然RNA分子，由于有局部的二级结构配对，不能和膜良好结合，但变性分子结合较好，故先要对RNA分子做变性处理（用DMSO，戊二醛，甲酰胺等），电泳后同Southern杂交法进行转移，此法称为Northern杂交。为了使转到硝酸纤维素膜上的核酸分子结合牢固，经得起杂交中及杂交后的洗涤，需将转移后的膜在80℃真空泵中烘烤2h或通过UV照射使核酸和膜交联。

决定杂交效率的因素包括探针的标记强度、探针扩散到靶核酸的速度及所形成杂交物的稳定性。预杂交液中使用焦磷酸钠及表面活性剂（如Ficoll、聚乙烯咯烷酮、肝素、多糖、鱼精DNA等）可减少靶核酸和探针分子的非特异结合，降低本底。杂交中的高盐浓度、低解离温度、低甲酰胺浓度将增强杂交信号形成，但为了保证杂交的特异性，必须用较高的杂交温度排除错配杂交，用一定量的低浓度盐溶液除去非特异性结合。使用核素标记的杂交物可使用放射自显影技术检测，非核素标记的杂交物可采用显色或发光法检测。