4.3.1　黄酒酿造中的真菌代谢特性

酵母是主要的产酒微生物，通过分离培养和发酵实验，发现酵母纯培养发酵可产生大部分风味物质，不同的黄酒酵母发酵对黄酒的基本理化指标没有显著影响，但黄酒的风味物质有显著差异。对福建红曲黄酒来源的10株非酿酒酵母和2株酿酒酵母进行研究，发现12株酵母产生的主体风味物质为醇酯类，8株非酿酒酵母与酿酒酵母的发酵能力无明显差异，而产生的风味总量有差异。比较不同酿酒酵母菌株产β-苯乙醇的能力，发现在无氨基酸培养基中来自浙江和上海的2株黄酒酵母几乎不产β-苯乙醇，推测2株黄酒酵母侧重于Ehrlich途径合成β-苯乙醇，这与啤酒和日本清酒酵母菌有较大的区别。对1株高产酯的维克汉姆酵母中乙酸苯乙酯的合成途径进行研究，发现此菌株中醇酰基转移酶合成途径对乙酸苯乙酯的合成有贡献，但酯酶合成途径对其更为关键。

曲霉属、根霉属、毛霉属、青霉属真菌是黄酒中的主要丝状真菌，其中曲霉属是广泛应用于酿酒的真菌类群，具有较高的糖化能力，同时对高糖和高盐有较强的耐受性，对分解淀粉质等多糖有着重要的作用。根霉属真菌不仅能够产生糖化酶、液化酶，将淀粉转化成小分子糖类物质，还能够生产酒精，并产生乙酸乙酯、乳酸乙酯、异丁醇、异戊醇、乙醛等风味物质。根霉中的米根霉营养要求简单，分泌酸性蛋白酶的能力较强，能发酵生产L-乳酸，故对黄酒风味的形成产生一定的影响。米根霉还是甜酒曲中主要的霉菌，对甜酒的发酵至关重要。曲霉属真菌可以分泌淀粉酶、蛋白酶、肽酶等多种酶类至环境中，对后酵中残余淀粉的水解有重要作用。烟曲霉具有条件致病性，但也可以产生植酸酶、几丁质酶等多种酶类，在酶工程领域有重要的用途。毛霉属具有丰富的复合酶系，能够分泌糖化酶、α-淀粉酶和蛋白酶等。

在黄酒酿造过程中，酒精和还原糖的含量不仅是保证黄酒质量的最重要的理化指标，它们的变化情况也间接反映了黄酒中微生物的生命活动状态。黄酒发酵前酵期主要是霉菌将淀粉等大分子物质降解为葡萄糖等小分子化合物，以及酵母菌通过有氧呼吸大量繁殖。为满足霉菌、酵母等对氧气的需要，一般会在发酵8～10h后通气1～2h，因此发酵起始还原糖含量处于较高水平、酒精含量较低。接下来的发酵过程中，好氧微生物的生理代谢消耗了发酵液中大量的氧气，使发酵体系形成一个缺氧环境，以酵母菌为主并包含部分细菌的微生物开始进行厌氧发酵，代谢葡萄糖等物质产生大量乙醇，使酒精含量迅速升高，还原糖含量减少。发酵4天后进入后酵期，温度较前酵低，环境变得恶劣，不再适合酵母菌的生长，此时酵母菌代谢缓慢，但仍有多种微生物进行代谢活动，产生复杂的风味物质。

江南大学联合传统培养方法对黄酒接种生麦曲中微生物进行分离培养及鉴定，测定了分离培养微生物制作熟麦曲的糖化酶、α-淀粉酶及酸性蛋白酶活力，同时对熟麦曲中挥发性风味成分的种类和含量进行了分析。初步对接种生麦曲中的酶活和风味物质进行溯源，进而了解黄酒酿造中微生物的代谢特性。发现霉菌是麦曲中糖化酶、α-淀粉酶及酸性蛋白酶的主要贡献者。以米曲霉接种制作的熟麦曲3种酶活的活性都很高，说明米曲霉确实是高产酶活的优良菌株，同时也说明了工厂采用改良过的黄曲霉苏-16进行接种制曲的科学性。黄曲霉不仅产酶活力高，同时由三代测序结果可知其在微生物群落结构中的相对丰度达到了22.72%，可见黄曲霉在接种生麦曲酶活方面充当着非常重要的角色。除了黄曲霉能够高产糖化酶外，霉菌中的烟曲霉（Aspergillus fumigatus JF9）也有着较高的糖化酶生产能力［563.1mg/（g·h）］，其次是芽枝状枝孢霉（Cladosporium cladosporioides JF10）、斜卧青霉（Penicillium decumbens JF1）及微小根毛霉（Rhizomucor pusillus JF2）、产黄青霉（Penicillium chrysogenum JF12）及红色红曲霉（Monascus ruber JF5）。

而在黄酒酿造所制作的纯种麦曲中，上述霉菌中部分霉菌的糖化酶生产活力却比较低。霉菌中黄曲霉苏-16依然是α-淀粉酶的主要来源，接种生麦曲中分离筛选菌株产α-淀粉酶活力较高的微生物是黄曲霉及黑曲霉（Aspergillus niger），其中斜卧青霉（Penicillium decumbens JF1）、产黄青霉（Penicillium chrysogenum JF4和JF12）在制作的熟麦曲中没有检测到α-淀粉酶活力。库德里阿兹威（氏）毕赤酵母（Pichia kudriavzevii JY4）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae JY5）、弗比恩酵母（Cyberlindnera fabianii JY7和 JY10）在制作的熟麦曲中检测到了α-淀粉酶活力，其中酿酒酵母JY5制作的熟麦曲的α-淀粉酶活力相对较高。枯草芽孢杆菌JX6和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens JX13）在制作的熟麦曲的α-淀粉酶活力分别达到了5.62g/（g·h）和8.66g/（g·h），产酶能力要高于米曲霉，较高的产酶性能除了能够更快分解物料，同时代谢产物可能对熟麦曲风味也有着一定的影响。

酸性蛋白酶的高低与曲香味可能有着更直接的联系，它降解原料中蛋白质形成的小分子物质，这些小分子物质是麦曲中风味物质重要的前体化合物。从接种生麦曲分离筛选出的菌株中黄曲霉和烟曲霉JF9在接种制作的熟麦曲中具有相对较高的酸性蛋白酶活力，其次是黑曲霉和微小根毛霉JF2。酵母菌中除了酿酒酵母JY5外，克鲁斯假丝酵母（Candida krusei JY6）、弗比恩酵母JY3和JY9制作的熟麦曲中也检测到了酸性蛋白酶酶活，这可能是非酿酒酵母对黄酒风味也有贡献的原因之一。

以分离培养的微生物制作纯种麦曲测定其中的挥发性风味物质的种类及含量发现，产生醇类挥发性风味物质能力居于前五的对应菌种分别为酿酒酵母JY5、克鲁斯假丝酵母JY6、枯草芽孢杆菌JX6、红色红曲霉JF5及米曲霉JF6，含量分别达到了6850.00μg/kg、1983.31μg/kg、1137.36μg/kg、1126.19μg/kg及1106.64μg/kg。其中酿酒酵母在接种生麦曲中的相对丰度为2.16%，可以推断酿酒酵母可能对接种生麦曲挥发性风味物质中醇类化合物的产生具有较大贡献。纯种麦曲中酯类化合物产量超过100μg/kg对应的微生物主要是酵母，其中酿酒酵母JY5和克鲁斯假丝酵母JY6两株酵母的产酯香能力较为突出。对接种生麦曲进行微生物群落结构测定时并没有检测到克鲁斯假丝酵母，但其突出的产酯香能力可能对接种生麦曲中酯类挥发性风味物质产生也有一定的作用。通常认为假丝酵母具有较强的产酯能力和产2-丁酮的能力。醛酮类化合物主要由霉菌类微生物产生，对纯种麦曲中生产醛酮类化合物含量高于100μg/kg按照从大到小排序，对应的微生物分别为黑曲霉（Aspergillus niger JF11）、微小根毛霉（Rhizomucor pusillus JF2）、米曲霉JF6及黑曲霉JF7。有3株微生物制作的熟麦曲中芳香族化合物含量大于500μg/kg，它们分别是米曲霉JF3、酿酒酵母JY5和克鲁斯假丝酵母（Candida krusei JY6）。熟麦曲中含氮化合物产量较高相对应的微生物为米曲霉JF3、产黄青霉菌（Penicillium chrysogenum JF12）及枯草芽孢杆菌JX6。

微生物之间混合培养能够通过影响微生物的代谢来影响发酵，进而影响发酵食品的品质。黄酒的发酵过程是一个多菌种协同发酵的过程，不同微生物在发酵过程中所发挥的功能有所不同。黄酒独特的体系风格的形成不是单个微生物功能的简单加和，必须要通过微生物的协同作用，在微生物互作的基础之上实现整体微生物群落功能的升华。不同的菌株之间的物理缔合和分子相互作用可以导致多种不同结果，如共生、竞争、抑制等，因此，研究发酵过程中主要微生物之间的相互作用对于改善黄酒风味和舒适度具有重大意义。研究发现酿酒酵母菌和干酪乳杆菌共培养能够提高酵母产谷胱甘肽的能力，美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）与酿酒酵母的混合发酵对风味物质的产生具有协同作用，可以产生更高浓度的脂肪酸、乙酯类及萜烯类物质。

黄曲霉苏-16为不产黄曲霉毒素菌株。苏-16在察氏培养基上培养菌落颜色为黄绿色，背面为红棕色，菌丝则为丝绒状；而清酒酿造用米曲霉MQ正面颜色则为绿色，背面颜色为棕色，菌丝状态为绒毛状。所以在颜色方面苏-16与米曲霉颜色差异并不巨大。AFPA培养基能改善真菌的生长速率，特别是产黄曲霉毒素的曲霉菌种，由于来自柠檬酸铁的铁离子与曲霉酸反应产生颜色化合物，苏-16的菌落底部发展出深橙黄色，对照菌株米曲霉MQ则为浅黄色，产黄曲霉毒素对照菌株黄曲霉3357为橙黄色（图4-8）。从结果来看，菌株MQ为米曲霉，苏-16为黄曲霉。

图4-8　AFPA培养基中菌落背面颜色

黄曲霉毒素是一种由黄曲霉和寄生曲霉等真菌经过聚酮途径产生的次生代谢产物，是一组结构类似的化合物总称。黄曲霉毒素的结构通常包含1个双呋喃环和1个氧杂萘邻酮，天然产生的黄曲霉毒素根据其化学结构不同分为B1、B2、G1、G2四种；生物体摄取黄曲霉毒素后会被细胞内的CYP450等酶系氧化形成代谢产物，主要包括黄曲霉毒素M1、M2、P1、Q1、B2a、G2a等。研究表明发霉食品或食品中检测到最多的则为AFB1。国家现行标准《食品安全国家标准　食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）对酱油、醋、黄酒等发酵类食品的黄曲霉毒素B1的限量为5μg/kg，小麦、大米、稻谷等的黄曲霉毒素B1的限量为5μg/kg。根据国标方法通过高效液相色谱检测结果表明，黄酒酿造用菌株黄曲霉毒素B1含量小于0.15μg/kg，G族黄曲霉毒素均小于定量限或检测限。产黄曲霉毒素标准菌株3357黄曲霉毒素产量如表4-1所示，总量高达30μg/kg以上。黄酒酿造用菌株黄曲霉毒素产量远低于产黄曲霉毒素标准菌株，也远低于国标限量，符合国家限量标准。根据我国粮食、豆类及发酵食品中黄曲霉毒素B1允许量标准（GB2761—781）规定为≤5μg/kg，因此黄曲霉苏-16并不属于产黄曲霉毒素菌株。

表4-1　纯种曲霉麦曲中黄曲霉毒素含量