第四节 心肌损伤的蛋白标志检测方法
一、肌钙蛋白
（一）胶体金法测定血清肌钙蛋白
1.原理 采用固相层析-双抗体夹心技术定性检测人血清（浆）心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）。检测卡的检测线处包被有固化的cTnI单克隆抗体，质控线处包被有抗IgG抗体。检测时，将血清（浆）滴入加样孔后，如标本中含有一定浓度的cTnI，则与膜中的胶体金标记的cTnI抗体结合形成复合物，该复合物通过毛细管作用向前移动，当移行至检测线处，被检测区内包被的未标记的抗cTnI特异抗体所捕捉，形成一条可见的紫红色带。
试剂盒提供配套的检测板、滴管等。
2.操作步骤
（1）把试剂盒、样品平衡至室温后，取出检测卡，于样品孔内滴加100～150μL血清（浆），15min内观察结果。
（2）结果判断：①阳性：在检测线和质控线处均出现紫红色带。如早于15min出现，也可判定为阳性。②阴性：质控线处出现紫红色带，检测线处无明显的紫红色带。阴性结果必须等到15min方可判断。③无效：标本加入15min后，在质控线处无紫红色带，则无论检测线处是否有紫红色带，均为无效，应重新检测。
3.评价
（1）本法方便、快捷，适合作床旁检测。但必须注意各试剂厂家的灵敏度不一致，差别较大，一般为0.3ng/mL，但也有1.0ng/mL的，在报告结果应予说明。
（2）待测样品最好用血清，不用抗凝血浆。EDTA是Ca2+螯合剂，可促使cTnI-TnC复合物的解离，使游离型cTnI增加，游离型cTnI易降解；肝素带有负电荷，可与cTnI结合形成复合物，影响抗原-抗体反应，进而引起结果错误。
（3）如检测线处包被的是心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）单克隆抗体，则测定的为cTnT。目前主张只测定其中一种，以下均以cTnI为例。
（二）免疫比浊法测定血清肌钙蛋白I
1.原理 将特异抗体结合于胶乳颗粒表面，标本中的cTnI与胶乳颗粒表面的抗体在反应缓冲液中结合，相邻的胶乳颗粒彼此交联，浊度增加，引起500～600nm波长处的吸光度增加，该增加幅度与标本中的cTnI含量成正比，以此定量cTnI。
2.主要试剂 由试剂盒配备，可能会略有不同。试剂1主要为含增敏剂和表面活性剂的缓冲液；试剂2为结合有特异抗体的胶乳颗粒。
3.操作步骤 以半自动分析仪为例，操作步骤如下（如为全自动分析仪，则按说明书要求进行参数设置和测定）。
（1）取150μL试剂1与25μL血清置测定管中，混匀，37℃水浴3min。
（2）加入90μL试剂2，混匀，移入比色杯中，立即放入37℃恒温比色槽。
（3）在500nm波长处，待延滞时间100s后，开始读数，连续监测吸光度变化速率，读数时间为120s。以线性反应期吸光度的增加速率进行多参数曲线拟合，根据参考工作曲线得出结果。
4.参考范围 95%单侧上限为0.8μg/L。
5.评价
（1）纤维蛋白或其他颗粒物质可造成假阳性，故标本于使用前需4000r/min离心10min，以确保去除该类干扰物。TB>680μmol/L、Hb>3.9g/L、TG>17.1mmol/L可干扰测定，应予避免。
（2）类风湿因子可与抗体结合导致胶乳聚集，出现假阳性。某些人体内存在的异种动物蛋白的抗体，如抗鼠抗体、抗兔抗体等也可与抗体结合，造成假阳性。
（3）目前cTnI测定尚未实现标准化，无法溯源至统一标准，因此各方法间无法进行直接的数值比较。其余评价同胶体金法评价（2）和（3）。
（三）ELISA法测定血清肌钙蛋白I
1.原理 双抗体夹心ELISA法。
2.主要试剂 由试剂盒配备，可能会略有不同，主要包括：抗cTnI抗体包被板、抗体-酶结合物、孵育缓冲液、浓缩洗液、终止液和显色剂、cTnI标准品等。
3.操作步骤 严格按照试剂盒说明书操作，主要包括如下步骤：混合→孵育结合→加酶孵育→显色与终止。最后在酶标仪上于450nm波长下测定吸光度值，根据标准品绘制标准曲线，然后根据标准曲线计算未知样品中cTnI浓度。
4.参考范围 0～0.15μg/L。
5.评价
（1）本试剂盒用于检测血清样品，肉眼可见的溶血、脂浊会影响测定。
（2）应在标本采集6h内进行检测，如不能及时进行，应将血清存于-20℃或更低温度，可保存3个月，但应避免反复冻融。
（3）用孵育缓冲液稀释具有较高浓度cTnI的血清，不可用蒸馏水稀释。
二、肌红蛋白
（一）ELISA法测定血浆（清）肌红蛋白
1.原理 样品中的肌红蛋白（myoglobin，Mb）和酶标记Mb竞争结合Mb特异抗体，酶标记Mb-Mb抗体复合物中的辣根过氧化物酶作用于底物（OPDH2O2）产生有色物质，颜色深浅与样品中Mb浓度成反比，查半对数坐标曲线即得样品Mb的浓度。
2.主要试剂 由试剂盒提供，可能会略有不同，主要包括：包被液、酶标记Mb溶液、底物溶液、稀释液、Mb标准品。
3.操作步骤 严格按照试剂盒说明书操作，主要包括如下步骤：抗体包被→加样与酶标抗体→显色终止与测定。最后在酶标仪上于492nm波长下测定吸光度值，以系列Mb标准的吸光度为普通坐标，以浓度为对数坐标绘制半对数标准曲线，然后根据样品吸光度值即可得出样品中Mb的浓度。
4.参考范围 2.5～22.8ng/L。
5.评价
（1）该法灵敏度高、特异性强、操作简单，可同时检测多个样本，检测的线性范围也较宽，可达1000μg/L。唯一的缺点是耗时稍长。
（2）血清肌红蛋白上午9时最高，下午6～12时最低。因此，连续监测时应注意定时采集标本，以免受生理节律的影响。
（3）理想的标本应该是新鲜采集的血清，最好无溶血、脂浊。分离后的血清可于2～8℃保存1天。不能及时测定的标本最好分装成小管，于-20℃冰冻保存，避免反复冻融。理想的血清标本最好不用促凝剂或抗凝剂，样品采集管中的分离胶也会干扰分析，标本采集后待其自然凝固或适度孵育后离心即可。
（二）胶乳增强免疫透射比浊法测定血浆（清）肌红蛋白
1.原理 将抗人Mb抗体包被至大小均匀的聚苯乙烯胶乳颗粒上，当待检血清与胶乳试剂在缓冲液中混合时，标本中的Mb与胶乳颗粒表面的抗体结合使反应混合液浊度增加，引起570nm波长处的吸光度值升高。通过绘制Mb浓度吸光度标准曲线，即可求出Mb的浓度。
2.主要试剂 由试剂盒提供，可能会略有不同，试剂1为甘氨酸缓冲液，试剂2为包被有抗人Mb抗体的胶乳颗粒。
3.操作步骤 全自动分析主要测定参数如下：①分析方法：两点终点法；②测光点：20～34；③样品/R1/R3：11/110/80；④主波长/次波长：570nm/800nm。
4.参考范围 ①血清：0～70μg/L；②尿液：0～5μg/L。
5.评价 本法最低检测限为20ng/mL，检测范围为20～750ng/mL。TB 680μmol/L、Hb 5g/L，以及1.5%的脂肪乳对本法无干扰。其余评价同ELISA法评价（2）和（3）。
（三）放射免疫分析法测定血浆（清）肌红蛋白
1.原理 同RA法原理，见本章第五节。
2.主要试剂 由试剂盒提供，可能会略有不同，主要包括：抗血清、125 I-Mb、Mb标准溶液、PR分离剂等。
3.操作步骤 严格按照试剂盒说明书操作，以B/B0%为纵坐标，相应的标准Mb浓度为横坐标绘制标准曲线。根据样品管的B/B0%，从标准曲线上查得Mb浓度。
4.参考范围 13～45μg/L。
5.评价 本法灵敏度高，最低检测范围可为2μg/L，特异性强，操作简便快速；但有放射性污染的危险。其余评价同ELISA法评价（2）和（3）。
三、脂肪酸结合蛋白
（一）ELISA法测定心脏型脂肪酸结合蛋白
1.原理 采用非竞争夹心酶联免疫吸附的原理，应用2株针对心脏型脂肪酸结合蛋白（heart fatty acid binding protein，FABP-H）不同表位的单克隆抗体，测定FABP-H含量。
2.主要试剂 由试剂盒提供，可能会略有不同，主要包括：FABP-H单克隆抗体、封闭液、洗涤液、底物液。
3.操作步骤 严格按照试剂盒说明书操作，主要包括如下步骤：包被→封闭→加样→加抗体→显色与终止。最后在酶标仪上于492nm/620nm波长下测定吸光度值，绘制标准曲线，然后根据标准曲线得出未知样品中FABP-H浓度。
4.参考范围 成人血浆FABP-H：1.57～8.97μg/L。
5.评价
（1）该法线性范围较宽，可达0～25ng/mL。特异性好，与肌红蛋白、肌球蛋白无交叉反应。血浆标本的批内变异系数（CV）为7%，批间CV为7.9%；尿液标本的批内CV为5%，批间CV为9.6%。
（2）血液标本用枸橼酸钠抗凝，静脉血1.8mL加109mmol/L枸橼酸钠溶液0.2mL，3000r/min离心5min取血浆待测或置入-20℃冻存。如为尿液，应新鲜采集。
（二）时间分辨荧光免疫法测定脂肪酸结合蛋白
1.原理 以F31型单克隆抗体作为捕获抗体，用铕（Eu）标记F12型单克隆抗体作为标记抗体，于时间分辨荧光计上测定荧光强度，其强度值与血清中FABP含量呈正比。
2.主要试剂 F31型单克隆抗体，F12型单克隆抗体，LANFLA增强液和洗涤液。
3.操作步骤 包被（每孔加入100μL F31型单克隆抗体标记包被反应板，4℃过夜后，洗涤3min×3次）→加样（标本100μL加入包被后的微孔板中，室温放置30min，洗涤3min×3次）→加抗体（各孔加F12型单克隆抗体100μL，室温放置30min，洗涤3min×3次）→增强与测定（每孔加增强液100μL，混匀后于时间分辨荧光计上测定荧光强度，并自动计算、打印出结果）。
4.参考范围 为0～2.0μg/L。
5.评价 本法灵敏度高，最低检测浓度为1μg/L，测定范围为1～300μg/L。