实验七 血清胆固醇的定量测定（磷硫铁法）

一、实验目的

掌握磷硫铁法测定血清胆固醇的原理和方法。

二、实验原理

1.胆固醇的生理功能

（1）参与血浆蛋白的组成；

（2）细胞膜的结构成分；

（3）胆汁酸盐、肾上腺皮质激素和维生素D等的前体。

2.测定原理

总胆固醇的测定有化学比色法（磷硫铁法和邻苯二甲醛法）和酶学方法（试剂盒）两类，本实验采用磷硫铁法测定血清胆固醇含量。

血清经无水乙醇处理，蛋白质被沉淀，胆固醇及其酯溶解在无水乙醇中。在乙醇提取液中，加磷硫铁试剂，胆固醇及其酯与试剂形成比较稳定的紫红色化合物，此物质在560nm波长处有特征吸收峰，可用比色法作胆固醇的定量测定。正常血清中胆固醇的含量有随年龄增大而增加的趋势，其平均正常值在110～220mg/100mL。

胆固醇含量在400mg/100mL内，与A（或OD）值呈良好线性关系。

三、实验仪器与试剂

（1）10%三氯化铁溶液 10g FeCl₃·6H₂O（A. R）溶于磷酸（A. R），定容至100mL。储于棕色瓶，冷藏。

（2）磷硫铁试剂 取10% FeCl₃溶液1.5mL于100mL棕色容量瓶内，加浓硫酸（A. R）至刻度。

（3）胆固醇标准储液 准确称取胆固醇 80mg，溶于无水乙醇，定容至100mL。

（4）胆固醇标准溶液 将储液用无水乙醇准确稀释 10倍即得。每毫升含0.08mg胆固醇。

四、实验内容

（1）吸取血清0.1mL于干燥离心管，先加无水乙醇0.4mL，摇匀后再加无水乙醇2.0mL，摇匀，10min后离心（3000r/min 5min），上清液备用（分两次加入乙醇的目的是使作用完全）。

（2）取干燥试管3支，编号，分别加入无水乙醇1.0mL（空白管）、胆固醇标准溶液1.0mL（标准管）、上述乙醇提取液1.0mL（样品管），各管皆加入磷硫铁试剂1.0mL，摇匀，10min后，分别转移至0.50cm光径的比色杯内，用分光光度计560nm比色。

硫磷铁试剂须沿管壁缓缓加入，与乙醇液分成两层，立即迅速振摇20次，放置10min（冷却至室温）后，于560nm进行比色，以空白管调零读取各管吸光度。

五、实验结果与计算

（1）通过制作标准曲线来求得血清胆固醇的含量。

（2）因胆固醇含量在400mg/100mL内，与A（或OD）值呈良好线性关系，可由吸光值A的比值求其含量A₂/A₁=C₂/C₁，本实验即用此法。

（3）如按方法（1）使用血清为样品，亦可根据线性关系计算：

血清胆固醇（mg/100mL）=（A₂/A₁）×0.08 ×（100/0.04）=（A₂/A₁）×200

式中 A₂——标准液吸光值；

A₁——样品液吸光值。

六、注意事项

（1）颜色反应与加硫磷铁试剂混合时的产热程度有关，因此，所用试管口径及厚度要一致；加硫磷铁试剂时必须与乙醇分成两层，然后混合，不能边加边摇，否则显色不完全；硫磷铁试剂要加1管混合1管，混合的手法、程度也要一致；混合时试管发热，注意勿使管内液体溅出，以免损伤衣服、皮肤、眼睛。

（2）所用试管和比色杯均须干燥，浓硫酸的质量很重要，放置日久，往往由于吸收水分而使颜色反应降低。

（3）空白管应接近无色，如带橙黄色，表示乙醇不纯，应用去醛处理。

（4）人血清胆固醇正常含量为2.8～5.9mmol/L（110～230mg/dL）。计算公式中的0.026为mg/dL转换成mmol/L的系数。