延长的复钙时间，如果能被1/10量的正常血浆所纠正，表示受检血浆中缺乏凝血因子;如果不能被等量的正常血浆所纠正，则提示受检血浆中有抗凝物质。

1.0. 1mol/L草酸钠或0.13mol/L枸橼酸钠抗凝的正常血浆和待测血浆。

2.0. 025mol/L氯化钙溶液。

按表1-4-3进行。

放置于37℃水浴中1分钟，加0.025mol/L氯化钙溶液0.1ml混合的同时启动秒表，记录血浆中出现纤维蛋白丝的时间(分钟)，重复两次，取平均值。

若第3管的复钙时间不能恢复至正常值( 2分18秒～4分17秒)，则表示受检血浆中有抗凝物质存在。

1.抽血应顺利，不应有溶血及凝血。

2.取血后应立即检测，血浆在室温中放置不超过2小时。

本试验可区别复钙时间延长的原因，是血液循环中有无病理性抗凝物质的一项筛查试验。

甲苯胺蓝可中和肝素的抗凝作用。当凝血酶时间( TT)延长，可在受检血浆中加入甲苯胺蓝，若延长的TT恢复正常或明显缩短，则表示受检血浆中肝素或类肝素增多，否则示其他抗凝血酶类物质存在。

1.0. 1%甲苯胺蓝溶液。

2.0. 1mol/L草酸钠或0.13mol/L枸橼酸钠抗凝血浆。

3.凝血酶溶液　凝血酶加生理盐水稀释，使正常对照血浆的凝固时间在16～18秒。

1.取受检抗凝血浆0.1ml，加0.1%甲苯胺蓝0.1ml，摇匀，置37℃水浴中。

2.随即加入凝血酶溶液0.1ml，即刻记录血浆凝固时间，重复2次或3次，取平均值。

在凝血酶时间( TT)延长的患者，加入甲苯胺蓝后TT明显缩短，两者相差大于5秒，提示患者血浆中有肝素或类肝素增多;如TT并不因为加入甲苯胺蓝而缩短，提示TT延长不是由肝素或类肝素物质所致。

凝血酶溶液在每次操作时都需作校正试验，使正常血浆的TT值在16～18秒。复钙交叉试验和游离肝素时间检测均为临床常用的病理性抗凝物质存在的筛选试验。前者可以鉴别凝血异常是内源凝血系统因子缺乏还是由病理性抗凝物质存在引起;后者对检测肝素或类肝素物质的存在比较敏感和特异。但二者均只是定性检测试验。

在过敏性休克，使用氮芥或放疗后，严重肝病，弥散性血管内凝血或肝叶切除后或肝移植术后等患者的血浆中可能有类肝素物质的增多。

发色底物法。

1. FⅩa试剂(含冻干牛FⅩa)。

2. AT (含冻干人AT和缓冲液0.05mol/L Tris-HCl，0.175mol/L NaCl，7.5mmol/L EDTA，pH 8.4)。

3.发色底物Spectrozyme FⅩa。

4.光电比色仪。

0.129mol/L枸橼酸钠1∶9抗凝血，以3000r/min离心10分钟。为彻底祛除剩余血小板，1小时内再以3000r/min离心10分钟。缺乏血小板血浆须保存在2～8℃，2小时内完成检测，或－20℃保存1个月，用前37℃融化15分钟。

加5ml蒸馏水，2～8℃可保存2周，－20℃可保存4个月。

加5ml蒸馏水，2～8℃可保存2周，－20℃可保存4个月。

加5ml蒸馏水，2～8℃可保存2个月，－20℃可保存6个月(勿反复冻融)。

用同样的方法采集正常血浆，以制备肝素标准品。以0.9% NaCl配成8USPU/ml的肝素，然后用正常血浆配成下列肝素标准品

0.8U/ml: 900μl血浆+ 100μl肝素( 8USPU/ ml) ;

0.4U/ml: 500μl血浆+500μl 0.8U/ml标准品;

0.2U/ml: 500μl血浆+500μl 0.4U/ml标准品;

0.0U/ml: 500μl血浆。

200μl AT，加25μl血浆样品或肝素标准品，混匀，37℃温育2分钟，加200μl FⅩa并混匀，37℃精确温育1分钟;混合液中加200μl发色底物Spectrozyme FⅩa，混匀，37℃精确温育5分钟;加200μl醋酸，混匀;最后，加200μl水。在波长405nm处读取吸光度值，空白对照液可按下列顺序配制: 200μl醋酸→200μl AT→25μl正常对照血浆→200μl FⅩa→200μl发色底物Spectrozyme FⅩa→200μl水。

以吸光度值与对应的肝素标准品浓度绘制标准曲线，纵、横坐标分别为405nm吸光度值和肝素浓度。待测血浆中肝素浓度可从标准曲线上直接查到。标准曲线应每次制备。

正常人用本法检测肝素为0。根据抗凝治疗的强度不同，本检测值有相应变化。本法检测肝素的范围是0～0.8U/ml。

1.采血与离心必须细心，以避免血小板激活，导致血小板第4因子( PF ₄)释放，后者可抑制肝素活性。

2.反应中温育时间和温度均应严格按要求，否则将影响检测结果。

3.严重黄疸患者检测中应设自身对照。

4.制作标准曲线的肝素制剂应与患者使用的一致。

5.采血时间必须与用药时间紧密对应，使检测结果可以指导临床的药物剂量调整。

6.肝素治疗个体差异较大，过量用药可以导致出血，用药不足无法避免血栓形成。肝素浓度的检测可以有效地提供药动学信息，指导临床合理调整药物的剂量。

在过敏性休克，使用氮芥或放疗后，严重肝病或DIC，肝叶切除后或肝移植术后等患者血浆中肝素增多。主要应用于肝素治疗的监测。

将受检血浆与正常人血浆混合，温育一定时间后，检测剩余因子Ⅷ的活性，以Bethesda单位来计算抑制物的含量，1个Bethesda单位相当于灭活50%因子Ⅷ的量。

1.0. 05mol/L咪唑缓冲液( pH 7.3)　咪唑0.34g，氯化钠0.585g，加蒸馏水至100ml。

2.白陶土-脑磷脂悬液。

3.缺乏因子Ⅷ血浆( FⅧ: C＜1%)。

4.正常人混合血浆。

5.0. 025mol/L氯化钙。

1.用咪唑缓冲液制备受检者1/2 (受检者血浆1份加缓冲液1份)和1/3 (受检者血浆2份加缓冲液1份)的稀释血浆。

2.温育混合物的制备　对照为正常人混合血浆0.2ml加缓冲液0.2ml;受检者1/2稀释血浆0.2ml加对照血浆0.2ml;受检者1/3稀释血浆0.2ml加对照血浆0.2ml。

将上述3支含混合物试管置37℃水浴箱中温育2小时。

3.用测FⅧ: C的方法，检测各管的Ⅷ: C水平。

按表1-4-4将剩余的FⅧ: C换算成Bethesda单位。

以Bethesda单位计算因子Ⅷ抑制物含量。

受检血浆稀释度×Bethesda单位=每毫升血浆中因子Ⅷ抑制物的Bethesda单位数。

举例:对照温育混合的因子Ⅷ: C =55%

受检血浆与正常( 1/2)对照血浆混合的因子Ⅷ: C =35%

从表1-4-4中查得，64%剩余因子Ⅷ为0.65 Bethesda单位。

同凝血因子Ⅷ: C测定。当筛查试验如复钙交叉试验、APTT纠正试验出现阳性结果时，患者有血友病A史或因子Ⅷ活性下降，用凝血因子Ⅷ抑制物测定( Bethesda法)可以定量反映抑制物的水平，用于血友病A患者产生因子Ⅷ抑制物或获得性血友病A的诊断与疗效的监测。该检测是一种经典的方法。

正常人体内无抑制物。

本法多用于血友病A患者出现抗因子Ⅷ: C抗体者，也用于获得性血友病A者;也可用于测定其他凝血因子所产生的抗体。

用蛇毒试剂激活FⅩ，加入Ca ^{2 +}和低浓度磷脂，观察血浆发生凝固的时间，称为Russell蛇毒时间( Russell viper venom time，RVVT)，作为狼疮抗凝物( lupus anticoagulation，LAC)的过筛试验( LAC screen)。若RVVT明显延长时，提示有凝血因子缺陷或存在LAC。加入正常血浆后，RVVT缩短，为凝血因子缺陷;若RVVT仍延长，表明存在LAC。加入高浓度的磷脂中和LAC后，可使延长的RVVT缩短或恢复正常，确证血浆中存在LAC，称为LAC确认试验( LAC confirm)。通过计算LAC screen或LAC confirm与正常人血浆RVVT的比值，得到LAC过筛试验比值( screen ratio，SR)和确认试验比值( confirm ratio，CR)，用筛查除以确认比值，得到标准化LAC比值( normalized LAC ratio，NLR)，根据NLR的大小，判断待测血浆中有无LAC。

1. LAC过筛试剂盒。

2. LAC确认试剂盒。

1.将LAC过筛试剂及LAC确认试剂各用2ml去离子蒸馏水溶解，置室温30分钟，颠倒混匀后备用。

2.将LAC过筛试剂及LAC确认试剂置于37℃水浴中预温1分钟。

3.取2个试管，各加0.2ml缺乏血小板的被检血浆，37℃预温1分钟。

4. LAC过筛试验，待检试管中加预温的LAC过筛试剂0.2ml，启动秒表，记录血浆凝固时间。若做LAC确认试验，待检试管中则加预温的LAC确认试剂，体积为0.2ml，启动秒表，记录血浆凝固时间。

5.正常人血浆同时进行上述检测。

1. LAC过筛试验比值( SR) =患者过筛试验结果(秒) /正常人过筛试验结果(秒)。

2. LAC确认试验比值( CR) =患者确认试验结果(秒) /正常人确认试验结果(秒)。

3.标准化LAC比值( NLR) =过筛试验比值/确认试验比值。

NLR:正常人:＜1.2;＞2.0为强阳性; 1.5～2.0为中度阳性; 1.2～1.5为弱阳性。

本试验对狼疮抗凝物检测的敏感性和特异性均较高。检测系统内磷脂的含量至关重要。要求待检血浆中尽量祛除血小板成分。在常规离心获得乏血小板血浆后，可以将所得的血浆吸取2/3，再次3000转离心10分钟，取后次所得血浆的上1/3用于检测。这样，可以避免剩余血小板磷脂参与反应，导致对检测结果的影响。

LAC是一组抗磷脂或磷脂与蛋白(如β-2-glycoprotein 1和凝血因子)复合物的抗体，可以干扰磷脂依赖的止血反应和体外凝血试验(如APTT、SCT、RVVT等)。血浆LAC阳性，可见于自身免疫性疾病(如SLE)、病毒感染、骨髓增生性疾病、复发性流产等，约有24%～36%患者可发生血栓形成。