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第六节 抗凝因子检验
一、抗凝血酶测定
(一)抗凝血酶抗原测定 【原理】
抗凝血酶抗原测定( antithrombin antigen，AT: Ag)采用酶联免疫吸附法。
【试剂与器材】
1.0. 1mol/L碳酸盐缓冲液( pH 9.6)。
2.抗人AT单抗。
3. AT标准品。
4.酶标的抗AT单抗。
5.洗涤液 0.01mol/L PBS (含0.05% Tween-20)。
6.样品稀释液 0.25mol/L EDTA-Na 2-PBS (含2%BSA)。
7.邻苯二胺溶液( 1mg/ml) 用pH 4.5 0.1mol/ L枸橼酸盐缓冲液配制。
8.3mol/L硫酸终止液。
9.30%过氧化氢溶液。
10.酶标仪。
【操作】
1.用碳酸盐缓冲液将抗AT单抗配制为适当浓度，加入到酶标板中，每孔0.1ml，4℃包被过夜。
2.用洗涤液洗去未结合的单抗。
3.将经样品稀释液一系列稀释的标准品及待测标本加入含固相抗体的酶标板中，每孔0.1ml，37℃温育2小时，再用洗涤液洗涤3次。
4.每孔加0.1ml适当浓度的酶标抗AT抗体，37℃再温育2小时，用洗涤液洗涤3次。
5.加新鲜配制的含1mg/ml邻苯二胺、3%过氧化氢的枸橼酸盐缓冲液，每孔0.1ml，显色10分钟。
6.每孔加0.05ml 3mol/L硫酸溶液终止反应。
7.在酶标仪上于492nm波长测各孔吸光度值。
8.以标准品的浓度为横坐标，尤其对应的吸光度值为纵坐标，在半对数纸上绘制标准曲线。
9.以待测样本的吸光度值从标准曲线上查出其对应的AT数值，再乘以稀释倍数，得出标本中AT: Ag的含量。
【参考区间】
( 290±30.2) mg/L。
【注意事项】
1.样本采用枸橼酸钠抗凝而不能用肝素抗凝血浆。
2.保存待检血浆从冰箱中取出后应立即置37℃水浴中融冻，但不能反复冻融。
【临床意义】
1.先天性AT缺陷 按AT: Ag及AT: A测定结果分为CRM －型( AT: Ag与AT: A均减低)和CRM +型( AT: Ag正常而AT: A减低)。
2.获得性AT缺乏，见于肝脏疾病、DIC、应用肝素等。
(二)抗凝血酶活性测定( antithrombin activity，AT: A) 【原理】
发色底物法。
【试剂与器材】
1.标准血浆。
2.底物S2238的浓度为5×10 －7mmol/L。
3.凝血酶溶液 牛凝血酶用生理盐水配成7.5～7.7U/ml，每10ml溶液中加入聚乙二醇6000 ( PEG6000) 0.5g混合。
4. Tris-肝素缓冲液 0.05mol/L Tris，7.5× 10 －3mol/L，EDTA-Na 2·2H 2O，1.75×10 －4mol/L氯化钠，用1mol/L盐酸调节pH至8.4，每升缓冲液中含肝素3万单位。
5.50%的醋酸。
6.酶标仪。
【操作】
1.将标准血浆及待测血浆按表1-4-2作一系列稀释。
表1-4-2 发色底物法检测AT: A标准管稀释
2.将一系列稀释的标准血浆及待测标本与Tris-肝素缓冲液混合，于37℃温育5分钟。
3.加过量的凝血酶50μl，混匀，37℃放置30秒。
4.加底物150μl，混匀，37℃精确温育30秒。
5.加50%的醋酸终止反应后，在405nm下测吸光度值。
6.以标准品AT: A为横坐标，以其相应的吸光度值为纵坐标，在半对数纸上作标准曲线。
7.根据受检者标本的吸光度值在标准曲线上查出其AT: A，若标本预先经过稀释必须乘以稀释倍数。
【参考区间】
( 108.5±5.3) %。
【注意事项】
AT: A的发色底物测定以往常用过多的肝素和凝血酶与待测血浆中AT作用后，测定剩余的凝血酶活性来反映AT的活性。由于凝血酶易使血浆纤维蛋白凝固，而且活性不如FⅩa稳定，所以在测定中用FⅩa替代凝血酶可以减少干扰和增加结果的稳定性。AT: A和AT: Ag同时测定，有助于AT缺陷症分型。
【临床意义】
同AT: Ag测定。
二、蛋白C测定
(一)蛋白C抗原测定 【原理】
蛋白C抗原测定( protein C antigen，PC: Ag)采用免疫火箭电泳法。
【试剂与器材】
1.抗人PC抗体。
2. PC缓冲液 每升溶液中巴比妥钠1.62g、Tris 5.65g、甘氨酸7.07g、EDTA-Na 21.80g、PEG ( MW 6000) 10g，pH调至8.8。
3.生理盐水。
4.标准血浆。
5.考马斯亮蓝染色液 取考马斯亮蓝R-250 2.5g，冰醋酸100ml，乙醇450ml，蒸馏水450ml，溶解后混匀。
6.考马斯亮蓝脱色液 取乙醇1000ml，冰醋酸250ml，蒸馏水1000ml，混匀。
7.电泳仪。
8.两分规。
【操作】
1.用PC缓冲液配制10g/L的琼脂糖溶液，制板方法与一般免疫火箭法相同。
2.将标准血浆稀释为原倍、1∶2 ( 100%)、1∶4、 1∶8、1∶16共5个稀释度。
3.待检血浆作1∶2稀释。
4.电泳 先于50V低电压下加样，每孔15μl，每板必须同时作标准曲线。待加样完后，提高电压至110V，在室温不高于30℃条件下电泳18小时。
5.染色 电泳完毕后关闭电源。取出琼脂糖凝胶板，置于生理盐水中漂洗杂蛋白(约12～24小时)，取出后用蒸馏水稍冲一下，除去盐类，用多层滤纸压干，以便吸去大部分水，再用电吹风吹干，然后用考马斯亮蓝染色3～5分钟，再用脱色液洗脱至底色白、峰形清晰为止。
6.测定火箭峰高度 用两分规测定火箭峰高度，以加样孔上缘至峰顶为准。将5个标准的各自读数，通过回归得到标准曲线。然后求出各待检样本的PC: Ag含量。
【参考区间】
( 102.5±20.1) %。
【临床意义】 1.先天性PC缺陷
Ⅰ型者PC: Ag含量与活性均降低，Ⅱ型者PC: Ag正常而活性降低。
2.获得性PC减少
可见于DIC、肝功能不全、手术后及口服双香豆素抗凝剂等。
(二)蛋白C活性测定 【原理】
蛋白C活性测定( protein C activity，PC: A)采用发色底物法。
【器材】
1.缓冲液A 0.04mol/L巴比妥缓冲液，pH 7.4。
2. Protac激活液 每瓶3U，加缓冲液A 3ml，分装，置－20℃保存，使用时稀释成0.15U/m。
3.发色底物液 用重蒸馏水将Chromozym-PCA配成1.6mmol/L。
4.正常混合血浆用缓冲液A稀释成浓度为原液、80%、60%、40%、20%、10%等。
5.待检样本用生理盐水作1∶2稀释。
6.终止液用冰醋酸溶液。
7.酶标仪及酶标板。
【操作】
1.将待测已稀释样本25μl加入酶标板孔中，同时也将6个不同稀释度正常混合血浆各25μl分别加入各孔内，在上述待测样本及标准管各孔加入激活液100μl，置37℃水浴温育8分钟。
2.再加入发色底物chromozym-PCA 100μl，混匀，置37℃水浴中继续温育10分钟，使其充分显色。
3.以缓冲液A为空白管，酶标仪405nm读出多孔的A值。
4.以正常人混合血浆的各稀释孔的A值为纵坐标，相应的PC: A含量为横坐标作出标准曲线。待测样本查标准曲线，结果乘以2。
【参考区间】
( 100.24±13.18) %。
【注意事项】
除本法外，尚有血浆凝固法。后者检测可能受到狼疮抗凝物( lupus anticoagulant，LAC)、高浓度的FⅧ(＞250%)等的影响。如果存在活化蛋白C抵抗( activated protein C resistance，APC-R)时，可出现血浆凝固时间假性缩短，将待测血浆用缺乏PC的基质血浆进行1∶2、1∶4等适当比例稀释后可以纠正。
【临床意义】
与PC: Ag相同。
三、蛋白S抗原测定
【原理】
蛋白S抗原测定( protein S antigen，PS: Ag)采用免疫火箭电泳法。血浆总PS ( TPS)包括游离PS ( FPS)和与补体C 4结合蛋白结合的PS ( C 4bp-PS)。火箭电泳法在琼脂板上可同时检测TPS 和FPS。在待测血浆中加一定量聚乙二醇6000，则C 4bp-PS会沉淀下来，上清部分即为FPS。
【试剂与器材】
1.抗人PS血清。
2.巴比妥钠缓冲液 每升含巴比妥钠10.32g、甘氨酸7.52g、Tris 0.6g、EDTA 1.46g、pH 9.0。
3.25%聚乙二醇6000 ( PEG6000)。
4.余同FⅧ: Ag的检测。
5.电泳仪。
【操作】
1.受检血浆用0.13mol/L枸橼酸钠抗凝，FPS处理同标准曲线制作，TPS与FPS均每孔加10μl，余均同标准曲线。
2.检测样品的峰高代入公式中X，Y为样本的PS值。
3.标准曲线绘制
( 1)取抗人PS血清，用巴比妥钠缓冲液配制成1%含PS抗血清的琼脂糖凝胶板。
( 2) TPS标准血浆稀释为原倍( 100%)，1∶2 ( 50%)，1∶4 ( 25%)，1∶8 ( 12.5%)，1∶16 ( 6.25%)。
( 3)每孔加样10μl。
( 4)电泳条件同PC: Ag检测。
( 5) FPS:吸取2支各300μl正常混合血浆，每支加25%聚乙二醇6000 50μl，充分混匀，室温下放置30分钟，然后以3000r/min离心10分钟，取上层血浆，一支作原倍( 100%) ;另一支作1∶2 ( 50%)，1∶4 ( 25%)，1∶8 ( 12.5%)，1∶16 ( 6.25%)稀释。与TPS在同一琼脂板上进行电泳。
( 6)染色:将电泳后的琼脂板置1%磷钼酸染色液中数分钟，一般5～15分钟(以磷钼酸液新鲜度而定，新鲜则短，使用多次后则相应延长染色时间)，即可见清晰的火箭沉淀峰。
( 7)采用直线回归，将测得的峰高与相应的血浆稀释度做直线回归处理，Y = bX + a。
【参考区间】
TPS: ( 96.6±9.8) %; FPS: ( 100.9± 11.6) %。
【注意事项】
1.游离PS标本，制备好的上层血浆应当天检测，否则会影响实验结果。
2.同一份标本，同时做TPS和FPS，加样时可以单孔为TPS样本;双孔为FPS样本，以便分析结果。
3.血浆中约60% C4BP-PS，40%为FPS。只有FPS辅助APC发挥灭活FⅤa和FⅧa功能。故检测FPS更有临床价值。
【临床意义】
1. PS作为PC的辅因子，对因子Ⅴa、Ⅷa有加速灭活作用。先天性PS缺陷者常伴发严重的深静脉血栓栓塞。
2.获得性PS缺乏 见于肝功能障碍、口服双香豆素类抗凝药物。
四、凝血酶-抗凝血酶复合物测定
【原理】
凝血酶-抗凝血酶复合物测定( thrombin antithrombin complex，TAT)采用酶联双抗体夹心法。
【试剂与器材】
1.以兔抗人凝血酶包被的酶标板。
2.以过氧化物酶标记的兔抗人AT。
3.共轭缓冲液。
4. TAT标准血浆A1～S4 (人)浓度范围2～60μg/L。
5. TAT质控血浆(人)。
6.样本缓冲液( TAT) Tris缓冲液100mmol/L，Tween-20 10ml/L，EDTA 37g/L。
7.洗涤液 磷酸盐缓冲液90mmol/L，含Tween 18g/L。
8.底物缓冲液 枸橼酸盐缓冲液含H 2O 2 0.3g/L。
9.底物 邻苯二胺。
10.终止液 0.5mol/L硫酸。
11.酶标仪。
【操作】 1.试剂准备
( 1 )洗涤液:用蒸馏水稀释15ml浓缩液至300ml。
( 2)工作共轭液:将200μl抗人AT抗体加至含共轭缓冲液的瓶中( 11ml)，轻轻振荡混匀。
( 3) TAT标准血浆S1～S4和TAT质控血浆各加1ml蒸馏水稀释，使S1～S4中TAT浓度分别为2μg/L、6μg/L、20μg/L、60μg/L。质控血浆TAT值如标签示。
2.检测
( 1)取所需数量的微量测试排条于托板上，其余的重新封存好，并于其中放干燥剂，保存于2～8℃。
( 2)每孔加50μl样本缓冲液( TAT)，再分别加入50μl标准品、质控血浆或样本，充分混匀。
( 3) 37℃温育15分钟(±2分钟)。
( 4)每孔用0.3ml稀释洗涤液洗板2次，甩干。
( 5)将100μl工作共轭液加至各孔。
( 6) 37℃温育15分钟(±2分钟)。
( 7)准备底物液:加10ml底物缓冲液( 20～25℃)至含底物的瓶中，振荡摇匀。
( 8)用洗涤缓冲液洗板3次。
( 9)每孔加100μl新鲜配制的底物液。
( 10) 20～25℃温育30分钟(避光)。
( 11)每孔加100μl终止液，放置时间同底物液。
( 12) 1小时内检测波长492nm处吸光度( A)值。
3.标准曲线绘制
标准曲线通过以TAT标准血浆的TAT浓度(μg/L)对相应吸光度值作图得到。纵坐标为492nm吸光度值，横坐标为TAT浓度(分别为2μg/L、6μg/L、20μg/L、60μg/L)。待测样品中TAT的浓度则可比照标准曲线得到。
【参考区间】
正常成人枸橼酸钠抗凝血浆TAT: 1.0～4.1μg/L (平均1.5μg/L)。
【注意事项】
1.在2～8℃环境下，共轭缓冲液、工作共轭液和样本缓冲液可保存4周，稀释过的洗涤液可在1周内使用。
2.稀释过的标准血浆和质控血浆在15～25℃下，可放置8小时。工作底物液须避光保存，且应在1小时内使用。
3.共轭缓冲液、标准血浆、质控血浆和样本缓冲液在－20℃可保存3个月。剩余的工作底物液应在配制后30分钟内冻存，2周内使用。
4.血浆样本采集不当可影响检测结果。溶血、脂血、含类风湿因子的血浆样本不可使用。
5.凝血酶形成后迅速被抗凝血酶所抑制。因此，常规方法无法直接测定凝血酶的生成量。TAT的测定，可以间接反映凝血酶的生成。作为早期血栓形成的一个辅助检测指标。
【临床意义】
血浆TAT含量增高，见于血栓形成前期和血栓性疾病，如DIC、深静脉血栓栓塞、急性心肌梗死等。