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第四节 血小板的检验
一、血小板功能的有关检验
(一)血小板聚集试验( platelet aggregation test,PAgT) 【原理】
在特定的连续搅拌条件下于富含血小板血浆( PRP)中加入诱导剂时,由于血小板发生聚集,悬液的浊度就会发生相应的改变,光电池将浊度的变化转换为电讯号的变化,在记录仪上予以记录。根据描记虚线即可计算出血小板聚集的程度和速度。
【试剂与器材】
1.血小板聚集测定仪及记录仪(量程10mV电子电位差计)。
2.富含血小板血浆( PRP)及乏含血小板血浆( PPP)。
3.100μl微量加液器、硅化试管及注射器或塑料试管及注射器。
4.血小板聚集诱导剂ADP、肾上腺素、胶原、花生四烯酸、凝血酶等。
【操作】
1.用硅化注射器从肘静脉顺利取血4.5ml,注入含有0.5ml 109mmol/L枸橼酸钠的硅化或塑料离心管中,充分混匀。
2. PRP (富含血小板血浆)的制备 以1000r/ min离心10分钟,小心取出上层血浆,计数血小板并调至( 100~200)×10 9/L。
3. PPP (贫含血小板血浆)的制备 将剩余血液以3000r/min离心20分钟,上层较为透明的液体即为PPP,其血小板一般低于( 10~20)×10 9/L。
4.将PRP标本置于仪器比浊管内(体积视聚集仪而定),放入测定孔内并调节透光度为10,并加搅拌磁棒,在37℃预热3分钟。
5.打开记录仪走纸开关,描记10秒的PRP基线,随后在PRP中加入诱导剂,同时开始搅拌( 1000r/min),测定时间为6~10分钟,记录走纸速度一般为2cm/min,记录聚集波型。
【参考区间】
1.浓度6×10 -6mol/L的ADP时MAR为( 35.2± 13.5) %,坡度为( 63.9±22.2)度。
2.浓度4.5×10 -5mol/L的肾上腺素可引起双相聚集曲线,此时第一相MAR为( 20.3±4.8) %;坡度( 61.9±32.9)度。
【注意事项】
1.避免反复穿刺而将组织液抽到注射器内,或将气泡混入。组织液可使少量凝血酶形成而引起血小板聚集。
2.时间 实验应在采血后3小时内完成。时间过长会降低血小板的聚集强度或速度。
3.温度 采血后的标本应放在15~25℃的室温下为宜,低温会使血小板激活,黏附、聚集能力增加或有自发性聚集,故切忌放入冰箱。
4.血浆的pH 采血后血液中的CO 2不断逸出使血浆pH上升。pH 6.8~8.5的标本可获得最佳聚集效果,pH低于6.4或高于10.0时,将会使聚集受抑制或消失。
5.抗凝剂 Ca 2 +是血小板聚集过程中的重要因素。血小板聚集程度随血浆中枸橼酸浓度的降低而增高,因此在贫血患者应按公式( 100-细胞比容)×血液( ml)×0.00185调整抗凝剂的用量。EDTA由于螯合Ca 2 +作用强,使ADP不能引起血小板聚集,因此忌用EDTA作为抗凝剂。
6.红细胞混入、溶血及血浆脂类等因素可降低悬液透光度,掩盖了血小板聚集的变化。因此,采血当天也应禁饮牛奶、豆浆和脂肪性食品。
7.药物 阿司匹林、氯吡格雷、双嘧达莫、肝素、双香豆素等均可抑制血小板聚集。阿司匹林抑制血小板聚集作用可持续1周,故采血前1周内不应服用此类药物。
8.血小板接触表面 接触血小板的玻璃器皿如未经硅化,可影响血小板凝集力,甚至使原来正常者出现异常结果。
9.诱导剂 ADP在保存中会自行分解产生AMP,所以配制成溶液后应在-20℃冰箱中贮存。一般半年内活性不会降低。应用肾上腺素时,应裹以黑纸避光,以减少分解。诱导剂的种类和浓度对血小板聚集结果有影响,因此临床判断时应该注明所用的诱导剂的浓度,以便进行对比。为此各实验室应有自己的参考值。
10.血小板聚集试验( PAgT)的测定方法较多,包括PRP透射比浊法、全血电阻抗法、剪切诱导法、光散射比浊法、微量反应板法和自发性血小板聚集试验等。PRP透射比浊法最常用,对鉴别和诊断血小板功能缺陷最有价值,但其不足是制备PRP时可因离心作用激活血小板,对小的血小板聚集块不敏感,高脂血症可影响PRP的透光度。全血电阻抗法应用全血标本,不需要离心血液,更接近体内血小板聚集的生理状态,可作为常规的手术前血小板聚集功能评价、血小板聚集功能增高监测、抗血小板药物疗效观察等,但其不足之处是每次测定需要清洗电极、检测时间长、对血小板的小聚集块不敏感等。
11. PRP透射比浊法测定时血小板的浓度对聚集率的影响较大,一般应调整为( 150~200)×10 9/L较为适宜。当患者全血血小板计数小于100×10 9/L或更低时,PRP的血小板浓度较低,可使血小板聚集率减低。
【临床意义】
1.血小板聚集率降低 见于血小板无力症、贮藏池病及低(无)纤维蛋白原血症、尿毒症、肝硬化、Wilson病、维生素B 12缺乏症、服用血小板抑制药物(如阿司匹林、氯吡格雷、双嘧达莫等)。
2.血小板聚集率增高 见于血栓性疾病,如急性心肌梗死、心绞痛、糖尿病伴血管病变、脑血管病变、高β-脂蛋白血症、抗原-抗体复合物、人工瓣膜、口服避孕药等。
3.阿司匹林抵抗AR标准 用10μmol/L ADP诱导血小板平均聚集率≥70%和用0.5mmol/L和AA诱导血小板平均聚集率≥20%。
4.在选用血小板聚集试验的激活剂时,应根据目的不同选择不同种类及其浓度。检测血小板聚集功能亢进时,宜选用低浓度( 2~3μmol/L)的ADP。检测血小板聚集功能缺陷时,如诊断血小板无力症,应选用高浓度( 5~10μmol/L)的ADP,并用多种诱导剂均出现聚集减低或不聚集时,才能确定血小板聚集功能缺陷。
5.服用阿司匹林时,花生四烯酸( AA)诱导的血小板聚集减低更为灵敏,适合于药物剂量与疗效监测。
6.瑞斯托霉素( ristocetin,RIS)诱导的血小板凝集试验( RIPA)并不导致血小板的激活,其凝集率的高低不反映血小板的聚集功能,仅与血小板GP Ⅰb和血浆中vWF有关。
(二)血浆β-血小板球蛋白(β-thromboglobulin,β-TG)和血小板第4因子( PF4)测定 【原理】
酶标双抗夹心法。
【试剂与器材】
1.测定β-TG ELISA试剂盒。
2.测定PF 4ELISA试剂盒。
3.酶标仪。
【操作】
具体操作详见试剂盒说明书,并严格按说明书步骤操作。
【注意事项】
1.每次必须同时测定系列标准抗原,以便作标准曲线。
2.凡ELISA测定中应注意的问题均要重视。
3.血浆β-TG和PF 4的影响因素较多,当血小板在体外被活化后,可致血浆水平假性增高。即使仅有1/1000的血小板在体外释放其α颗粒的内含物,血浆β-TG、PF 4就可成倍增加,二者比例变化不大;此外,当肾脏排泄功能异常、血小板破坏过多时,血浆β-TG、PF 4也可增高。而体内血小板活化,α颗粒内含物所释放的β-TG、PF 4同步升高,但后者可以和内皮细胞表面的硫酸乙酰肝素结合使血浆含量减低,β-TG/PF 4比值升高。同时进行血浆β-TG和PF 4测定,有助于判断血小板是否在体外活化。
【参考区间】
血浆β-TG为( 16.4±9.8) ng/ ml; PF 4为( 3.2±2.3) ng/ml。
【临床意义】
血浆β-TG和PF 4增高表示血小板被激活及其释放反应亢进,见于血栓前状态和血栓栓塞性疾病,例如急性心肌梗死、脑血管病变、尿毒症、妊娠期高血压疾病、肾病综合征、糖尿病伴血管病变、弥散性血管内凝血、静脉血栓形成。
(三)血浆P-选择素( p-selectin)测定 【原理】
酶联双抗夹心法。
【试剂与器材】
1.可拆式包被反应条。
2.酶标抗体。
3.标准品。
4.底物OPD片剂。
5.稀释液。
6.洗涤液。
7.底物缓冲液。
8.终止液。
【操作】 1.静脉采血
以1/10体积抽取静脉血置2%EDTA-Na 2塑料抗凝管,3000rpm离心10分钟,收集血浆。
2.标准品的稀释
将标准品用300μl稀释液准确复溶,用稀释液作5次倍比稀释,得六个( 2.5、5、10、20、40、80ng/ml)标准点。
3.加样
每孔加不同浓度标准品或待测血浆100μl,空白对照孔中加入稀释液100μl,37℃孵育90分钟。
4.洗涤
弃去反应孔内液体,用洗涤液注满各孔,静置3秒,甩干,反复三次后拍干。
5.加酶标抗体
每孔加入酶标抗体100μl,37℃孵育60分钟。
6.洗涤
弃去反应孔内液体,用洗涤液注满各孔,静置3秒,甩干,反复三次后拍干。
7.显色
临用前每片OPD用5ml底物缓冲液溶解。每孔加底物液100μl,37℃孵育15~20分钟。
8.终止
每孔加终止液50μl。
9.比色
在酶标仪上492nm处,以空白孔调零,测定各孔A值。
10.数据计算
以A492/标准品作标准曲线,随后由标准曲线查出待测样品P-选择素含量。
【参考区间】
9.4~20.8ng/ml。
【注意事项】
1.采血过程应严格、仔细,采血后应尽快分离血浆,避免血小板被激活,引起P-选择素假性增高。
2. ELISA试验应严格按操作基本要求进行,否则易造成白板、颜色浅、污染等现象。
3.实验温度条件以25℃以下为佳。
【临床意义】
血浆P-选择素水平增高可反映体内血小板或内皮细胞活化程度,并可为动静脉栓塞等血栓性疾病,糖尿病等代谢性疾病以及免疫炎症性疾病等病程、病情观察及疗效评估,提供较特异判断指标。
(四) 11-去氢-血栓烷B2( 11-DH-TXB2)测定 【原理】
酶联抗体竞争法。
【试剂与器材】
1.11-DH-TXB 2抗血清。
2.乙酰胆碱酯酶标记的11-DH-TXB 2。
3.11-DH-TXB 2标准品。
4. EIA缓冲液。
5.洗涤液。
6. Tween-20。
7.包被微量测试板。
8. Ellman试剂( Sigma)。
9.酶标仪。
【操作】
1.标本 静脉血1.8ml以2%的EDTA-Na2 0.2ml抗凝,以3000r/min离心15分钟。取得上层血浆,立即提取或于-20℃储存。
2.酶标板以纯化的鼠抗兔IgG包被( 2μg/孔),并用牛血清白蛋白( BSA)封闭。
3.测定前甩干液体。
4.依次加入倍比稀释的11-DH-TXB 2标准品(从125ng/L开始稀释,共8个稀释度)或待测血浆(直接测定)各50μl/孔、兔抗11-DH-TXB 2抗体50μl/孔和经乙酰胆碱酯酶标记的11-DH-TXB 2 50μl/孔。
5.混匀后置4℃过夜。
6.以洗涤液洗板5次后加入酶底物( Ellman)试剂200μl/孔。
7.用酶标仪在410nm处测定各孔的吸光度值。
8.用半对数纸绘制标准曲线,样品含量从曲线中查得。
【参考区间】
( 4.5±2.5) ng/L。
【注意事项】
血小板花生四烯酸( AA)代谢的主要活性产物是血栓烷A 2 ( TXA 2),TXA 2不稳定,半衰期约30秒,很快转变为稳定、无活性的TXB 2,因而测定血浆TXB 2可反映血小板的AA代谢状态。然而,当血液中血小板在体外被活化后,可致血浆TXB 2水平假性增高。11-DH-TXB 2是体内TXB 2经肝脏氧化酶或脱氢酶代谢的产物,由肾脏排出,其浓度不受体外因素或操作的影响。因此,比TXB 2水平更能准确地反映体内血小板TXA 2的合成情况;尿11-DH-TXB 2检测较血液检测更加便利。
【临床意义】 1.11-DH-TXB2增高
见于糖尿病、动脉粥样硬化、急性心肌梗死等血栓前状态和血栓病。
2.11-DH-TXB2减少
见于服用阿司匹林等非甾体抗炎药或先天性血小板环氧化酶缺陷患者。
二、血小板数量的有关检验
(一)改良MAIPA法检测血浆中糖蛋白特异性自身抗体测定 【原理】
羊抗鼠抗体包被酶标板后,俘获特异的抗血小板膜糖蛋白单抗。将患者血浆与血小板孵育后裂解,裂解液加入俘获单抗的羊抗鼠IgG包被的96孔酶标板上。再加入碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG,显色反应的深浅与患者血浆中抗体水平呈正相关。
【试剂与器材】
1.1. 5% EDTA。
2.0. 01mol/L pH 7.4 PBS。
3.5% PBS/EDTA“0.01mol/L pH 7.4 PBS 94ml + 5% EDTA 6.6ml。
4.0. 1mol/L HCl。
5.0. 2mol/L NaOH。
6.底物缓冲液 二乙醇胺48.5ml,1mol/L HCl 30.0ml,ddH 2O 421.5ml,MgCl 2·6H 2O 50.0ml,10% NaN 31.0ml,pH调至9.8。
7.底物溶液 PNPP ( 4-nitrophenylphosphat C 6H 4NO 6PNa 2·6 H 2O) ( Bohringer Mannheim GmbH) 100mg,底物缓冲液12.25ml。需现配,避光。
8.溶解缓冲液 Trizma-HCl 6.61g,Trizma-Base 0.97g,NaCl 8.5g,Triton X-100 10ml,ddH 2O加至1L,pH调至7.4;用时加入10mg/ml的蛋白酶抑制剂( Leupeptin Sigma公司,25mg粉剂加2.5ml ddH 2O稀释成终浓度10mg/ml分装到EP管内-20℃冷藏备用)。
9.稀释缓冲液 Trizma-HCl 6.61g,Trizma-Base 0.97g,NaCl 8.5g,Triton X-100 5ml,Tween-20 0.5ml,ddH 2O加至1L,pH调至7.4。
10. PBS/Tween 0.01mol/L PBS 4L,Tween-20 2ml。
11.单抗稀释液 0.01mol/L PBS/Tween/1% BSA。
12.封闭液 0.01mol/L PBS/Tween/3% BSA。
13.碳酸缓冲液 Na 2CO 30.8g,NaHCO 31.47g,NaN 30.1g,ddH 2O加至500ml,pH调至9.6。
14.抗体包被液 17μl羊抗鼠抗体+ 10ml碳酸缓冲液(亲和纯化的羊抗鼠抗体,1.5mg,浓度1.8mg/ml,缓冲液0.01mol/L Na 3PO 4,0.25mol/L NaCl,pH 7.6,2~8℃保存)。
15.单抗CD41 特异性抗血小板糖蛋白( GP) Ⅱb/Ⅲa。
16.单抗CD42b 特异性抗血小板糖蛋白( GP) I。
17.聚苯乙烯酶标反应板。
18.酶标仪。
【操作】 1.抗体包被
( 1)羊抗鼠抗体包被:抗体包被液10ml,抗体终浓度3μg/ml,加样每孔100μl。
( 2) 4℃孵育过夜。
( 3) 0.01mol/L PBS/Tween洗涤两次,甩干。
( 4)每孔加200μl,封膜,置室温下30分钟。
( 5)去除封闭液,吸干。
( 6)即用,否则塑料薄膜覆盖,置-70℃备用。
2.单抗俘获
( 1)制备单抗稀释液( 4μg/ml)。
( 2)抗体包被多孔板:每孔加入50μl单抗稀释液。
( 3)盖膜,摇床,室温孵育60分钟。
( 4) 0.01mol/L PBS/Tween洗板3次。
( 5)盖膜,待用于MAIPA。
3.改良MAIPA
( 1)于两个大塑料离心管中收集O型正常人血小板,2000转10分钟,用6~8ml PBS/EDTA洗涤,用吸管吹匀血小板,2000转,离心10分钟。重复2次。
( 2) 2~3ml PBS/EDTA重新悬浮血小板。
( 3)调整血小板浓度为1×10 9/ml。移至1.5ml EP管中,每管约110μl左右,含血小板1× 10 8个。
( 4)每管加入110μl待测血浆,混匀后,室温孵育60分钟。
( 5)加0.6ml PBS/EDTA,混匀,3000×g离心2分钟,弃去上清,此为第一次洗涤;再加0.6ml PBS/EDTA,吹匀血小板,洗涤离心,再重复2次。第3次离心后,扣干上清液。
( 6)每管加入血小板裂解液110μl溶解血小板,振荡混匀,置于4℃冰箱,摇床孵育30分钟。
( 7)离心分离,4℃,26 000×g,离心30分钟以去除不溶解的物质。
( 8)取上清液90μl,用360μl稀释缓冲液稀释。
( 9)取上述制备的稀释上清液100μl加样至俘获单抗的羊抗鼠IgG包被的96孔板上,设双复孔,摇床,室温孵育60分钟。
( 10) 0.01mol/L PBS/Tween洗涤4次。
( 11)每孔加入100μl碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG ( Sigma公司)。
( 12)封膜后,摇床,室温孵育60分钟。
( 13) 0.01mol/L PBS/Tween洗涤6次(每孔约加300μl洗涤液)。
( 14)加入100μl PNPP/底物缓冲液,37℃水浴箱孵育2~3小时,至显色。
( 15) 405nm、490nm观察结果。用405nm OD值减去490nm OD值。每板设4个正常对照,OD值大于正常均值+3倍标准差为阳性。
【参考区间】
阴性。
【注意事项】
1.注射器和试管必须涂硅或用塑料制品。
2.标准曲线及代测标本均应作双份,如两孔A值相差≥0.1,均应重测。
3.因皮质激素可影响结果,故应停药2周以上才能抽血检测。
4.血小板自身抗体检测的方法较多,MAIPA是目前检测特异性血小板自身抗体最主要的方法。已有报道用MAIPA检测血小板的洗脱液比血浆的自身抗体阳性率更高。用流式微球液相芯片技术可以同时检测多种血小板自身抗体。研究表明血小板自身抗体主要是针对GPⅡb/Ⅲa和GPⅠb/Ⅸ抗原表位的抗体,其他可见抗GPⅠa/Ⅱa、GPⅣ、GPⅤ、GMP-140和HLA-ABC等。一般情况下,与循环血小板结合的抗体多为抗血小板膜蛋白的抗体,血浆中游离的自身抗体可有抗血小板内成分的抗体。IgG型抗体被证实起最重要作用,而IgM和IgA型抗体较少。
【临床意义】
1.作为诊断原发免疫性血小板减少症( ITP)的指标之一。
2.作为ITP观察疗效及估计预后的指标。
3.有助于研究其他一些疾病的免疫机制,如系统性红斑狼疮( SLE)、Evans综合征、慢性活动性肝炎、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤和药物性免疫性疾病等。
(二)血小板寿命测定 【原理】
TXB 2放射免疫法。
【试剂与器材】
1.血小板分离液(相对密度1.077)。
2. TEN血小板洗涤液。
3.0.05mol/L PBS ( pH 7.4),含0.02mol/L Tris ( pH 7.4),9mmol/L EDTA-Na 2,0.15mol/L NaCl溶液。
4.花生四烯酸。
5. TXB 2放射免疫测定试剂盒。
【操作】
1.一次性口服阿司匹林0.6g。
2.服药前和服药后2天、4天、6天、8天、10天、12天分别取血( 0.05mol/L EDTA-Na 2抗凝),分离血小板,洗涤,并将血小板数调至10 7/L。
3.取血小板悬液0.2ml,加花生四烯酸(终浓度0.33mmol/L) 0.2ml,37℃温育10分钟,以3000r/min离心10分钟,取上清液置低温冰箱保存待测。
4. TXB 2放射免疫测定。
【参考区间】
( 9.3±1.7)天。
【注意事项】
1. PRP中血小板浓度宜在500×10 9/L以上。
2.洗涤血小板时应充分洗去血浆蛋白。
3.血小板寿命测定操作较烦琐,抽血量多,因患者服用阿司匹林后有加重出血的危险性。本检测患者的依从性差,目前已经较少应用。
【临床意义】
血小板生存时间缩短见于血小板破坏增多或消耗过多性疾病,如特发性血小板减少性紫癜、输血后紫癜、脾功能亢进、弥散性血管内凝血、各种血栓病(心肌梗死、糖尿病、外科手术、恶性肿瘤等)。
(三)抗心磷脂抗体测定 【原理】
酶联免疫吸附法。
【试剂与器材】
1.心磷脂乙醇溶液20mg/L。
2.辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG、IgM 或IgA。
3.洗涤液0.01mol/L PBS,pH 7.4。
4.显色液。
5.终止液。
6.酶标仪。
【操作】 1.包被
每孔加30μl心磷脂乙醇溶液,置4℃过夜,次日每孔加10%小牛血清0.2ml封闭,室温放置2小时。
2.反应
洗涤液洗板1次,被检血清用10%小牛血清稀释100倍。每孔加稀释后的被检血清50μl。室温2小时后用洗涤液洗板4次。加入酶标记的抗人IgG (或IgM,或IgA) 100μl,室温1.5小时后洗板4次。加显色液50μl/孔,37℃反应20分钟,加2mol/L硫酸50μl中止反应。
3.测量
用酶标仪在492nm处测定各孔的吸光度值。
【结果判断】
大于正常人血清吸光度值加两个标准差时为阳性。
【参考区间】
IgG型抗心磷脂抗体少于或等于26%; IgM型抗体少于或等于21%; IgA型抗体少于或等于25%。
【临床意义】
1.各种自身免疫性疾病(系统性红斑狼疮、原发免疫性血小板减少症、风湿性关节炎和抗磷脂综合征等)、病毒感染、肝硬化、恶性肿瘤、心肌炎、冠心病、高血压和脑血栓等疾病中增高。
2.某些药物(如氯丙嗪、吩噻嗪)治疗时,血浆中抗心磷脂抗体浓度升高。
3.少数正常老年人也能检出抗心磷脂抗体。