全国临床检验操作规程(第4版)
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第三节 血管壁和内皮细胞的检验

一、出血时间测定

【原理】

出血时间测定( bleeding time,BT)是指皮肤受特定条件的外伤后,出血自行停止所需要的时间。该过程反映了皮肤毛细血管与血小板的相互作用,包括血小板的黏附、活化、释放和聚集等反应。当与这些反应相关的血管和血液因子,如血管性血友病因子( vWF)和纤维蛋白原含量( Fg)等有缺陷时,出血时间可出现异常。

【试剂与器材】

1.血压计。
2.出血时间测定器 为双刀片弹簧装置。
3.干净滤纸。
4.秒表。

【操作】

具体步骤可参照卫生行业标准WS/T 344—2011《出血性时间测定要求》。
1.血压计袖带缚于上臂,加压。成人维持在40mmHg,儿童维持在20mmHg处。
2.在肘前窝凹下二横指处常规消毒,轻轻绷紧皮肤,避开血管、瘢痕、水肿,置出血时间测定器使它贴于皮肤表面,注意刀片的长度与前臂相平行,按其按钮,使刀片由“测定器”内刺入皮肤,见创口出血即启动秒表。
3.每隔半分钟,用干净滤纸吸取流出血液,直至出血自然停止,按停秒表计时。

【参考区间】

( 6.9±2.1)分钟。

【注意事项】

1.采血部位应保暖,血液应自动流出。
2.由于刺入皮肤的刀片的长度和深度均固定,故本法测定的结果较为准确。
3.滤纸吸干流出血液时,应避免与伤口接触。
4.试验前1周内不能服用抗血小板药物,如阿司匹林等,以免影响结果。
5. WHO推荐的模板法( template bleeding test,TBT)或出血时间测定器法,皮肤切口的长度和深度固定,测定结果较为准确。
6. BT一般不作为常规筛查试验。对有皮肤及黏膜出血表现、疑为初期止血缺陷的患者,可检查BT。
7.试验前一周应停用抗血小板药物,如阿司匹林、氯吡格雷等。

【临床意义】 1. BT延长

见于血小板数量异常,如血小板减少症;血小板质量缺陷,如先天性和获得性血小板病和血小板无力症等;见于某些凝血因子缺乏,如血管性血友病( vWD)和弥散性血管内凝血( DIC)等;还可见于血管疾病,如遗传性出血性毛细血管扩张症和单纯性紫癜等。

2. BT缩短

见于某些严重的血栓病,但不敏感。

二、内皮细胞功能的检验

(一)血管性血友病因子抗原测定 【原理】

血管性血友病因子抗原测定( von willebrand factor antigen,vWF: Ag)采用酶联双抗体夹心法。

【试剂与器材】

1.抗vWF单抗。
2.辣根过氧化物酶标记的抗vWF单抗。
3.聚苯乙烯酶标反应板。
4.牛血清白蛋白( BSA)。
5.邻苯二胺( OPD)。
6.正常人混合血浆。
7.酶标仪。

【操作】

1.单抗以0.1mol/L碳酸盐缓冲液( pH 9.5)稀释成10μg/ml后加入反应板中,0.2ml/孔,湿盒于4℃过夜。
2.0. 05% Tween-20,0.01mol/L磷酸盐缓冲液( pH 7.4) ( Tween-PBS)洗3次后加入用0.4% BSAPBS稀释的待测血浆或培养液上清,0.2ml/孔,37℃温育2小时。
3.同前洗涤3次后加入用同上缓冲液稀释的酶联vWF单抗,每孔0.2ml,37℃温育2小时。
4.同前洗涤5次后每孔加底物溶液( OPD 1mg/ml,用0.1ml/L,pH 4.5的枸橼酸盐酸缓冲液配制,30%过氧化氢0.5μl/ml) 0.2ml,室温置约5分钟后各孔加3mol/L硫酸0.05ml终止反应。
5.室温置10分钟后测定492nm吸光度值。
6.标准曲线 正常人混合血浆以0.4% BSA-PBS 按1∶20、1∶50、1∶100、1∶200、1∶500、1∶1000六种浓度稀释,与待测样品在相同条件下测定。

【结果计算】

以正常混合血浆vWF浓度为100% 或1U/ml。混合血浆6种稀释度的吸光度值与其相对应的浓度值在双对数坐标纸上绘制标准曲线,然后以标本吸光度值查找对应浓度值,也可以线形回归方程计算浓度。

【参考区间】

107.5%±29.6%。

【临床意义】

1. vWF: Ag浓度减低是诊断vWD的重要指标。
2. vWF: Ag浓度增高见于周围血管病变、心肌梗死、心绞痛、脑血管病变、糖尿病、肾小球疾病、尿毒症、肺部疾病、肝脏疾病、妊娠期高血压疾病、大手术后和剧烈运动。

(二)血管性血友病因子瑞斯托霉素辅因子测定 【原理】

在瑞斯托霉素( ristocetin)存在的条件下,vWF通过与血小板膜糖蛋白Ⅰb ( GPⅠb)相互作用可使正常血小板发生凝聚。洗涤并固定的正常血小板加入瑞斯托霉素和待测样品中,可从血小板凝聚的程度来计算样品中血管性血友病因子瑞斯托霉素辅因子( von willebrand factor ristocetin cofactor,vWF: Rco)的活性。此反映vWF的活性。

【试剂与器材】

1.甲醛。
2.正常人混合血浆和受测血浆分别以0.13mol/L枸橼酸钠1∶9抗凝。
3.瑞斯托霉素。
4. BSA。
5.血小板聚集仪。

【操作】

1.正常人洗涤血小板加等体积2%甲醛(用0.01% mol/L TBS,0.01% mol/L EDTA,pH 7.5配制),4℃置18分钟。2500×g离心10分钟上清液,加上述TBS-EDTA缓冲液洗涤3次,调成2×10 8/ml的浓度。
2.待测样品0.05ml加血小板悬液0.2ml,1000r/min匀速搅拌1~2分钟,再加10μl瑞斯托霉素(终浓度为1.25mg/ml),血小板聚集仪测定其血小板凝聚程度。
3.标准曲线 正常混合血浆用含4%BSA的上述缓冲液以1∶2~1∶32的比例稀释,并以与测定样品同样的条件测定各自的血小板凝聚强度。

【结果计算】

以正常人混合血浆的vWF: Rco活性为100%。标准曲线各点凝聚强度值及其对应稀释度在双对数坐标纸上绘制标准曲线,然后以受测标本凝聚强度值查出对应vWF: Rco活性值( %)。

【参考区间】

50%~150%。

【注意事项】

1.本试验若以EDTA抗凝,测定结果不准。
2.试管和注射器均应涂硅,或使用塑料制品。
3.在vWF检测中,vWF: Ag的定量最常用,以前多采用免疫火箭电泳,现已较少用。ELISA也可用于定量vWF: Ag,但以胶乳颗粒增强的免疫比浊法最为简便、快速。vWF: A主要是指vWF的GPⅠb受体分子数量,可在自动凝血仪上与抗原同时测定。计算vWF: A/vWF: Ag比值,对血管性血友病( vWD)的分型有价值。
4. vWF: Rco和瑞斯托霉素诱导的血小板凝集试验( RIPA)是最常用的vWF功能试验,vWF多聚体分析是诊断vWD最为特异的试验,但检测方法难度较大,一般实验室难于常规检测。对一些疑难病例,在有条件时可进行基因诊断。
5.测定FⅧ的凝血活性( FⅧ: C)并计算FⅧ: C/vWF: Ag的比值,也有助于血管性血友病( vWD)的诊断与分型。

【临床意义】

大部分vWD患者本试验结果降低,表明vWF功能减退;若vWF: R CO与vWF: Ag同时测定,对vWD的诊断更有价值。

(三) 6-酮-前列腺素F1α测定 【原理】

6-酮-前列腺素F1α( 6-ketone-prostaglandin F1α,6-ketone-PGF1α)测定采用酶联竞争抗体法。

【试剂与器材】

1.0. 05mol/L碳酸盐缓冲液( pH 9.6)。
2.0. 05mol/L PBS ( pH 7.2)。
3.0. 1mol/L柠檬酸盐缓冲液( pH 4.5)。
4.6-酮-PGF1α-牛血清白蛋白连接物( 6-酮-PGF1α-BSA)。
5.6-酮-PGF1α标准品。
6.兔抗6-酮-PGF1α-IgG。
7.羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶联结物(酶标第二抗体)。
8.邻苯二胺( OPD)。
9.30%过氧化氢。
10.明胶(用碳酸盐缓冲液配成0.3%浓度)。
11. Tween-20。
12.3mol/L硫酸。
13.酶标仪。

【操作】

用碳酸盐缓冲液将6-酮-PGF1α-BSA作一定稀释后包被酶标反应板。用0.3%明胶封闭。加入标准品(倍比稀释成12.5~1600pg/ml浓度)或待测样品、抗6-酮-PGF1α-IgG后在37℃温育2小时。洗涤后再加酶标第二抗体在37℃反应2小时。以OPD-过氧化氢为基质显色20分钟,加3mol/L硫酸中止反应,在酶标仪上测定490nm处的吸光度值。

【结果计算】

B/B 0( %) = A标准品或样品-A非特异/A零标准孔-A非特异×100%。
以标准品含量为横坐标,B/B 0( %)为纵坐标,在半对数纸上做标准曲线。根据样品孔B/B 0( %)值在标准曲线上读出6-酮-PGF1α的含量。
样品6-酮-PGF1α浓度( pg/ml) =测定值×10。

【参考区间】

( 17.9±7.2) pg/ml。

【注意事项】

1.配制明胶时,可加热至40℃。
2.其他与ELISA法测定的注意事项相同。
3. PGI 2半衰期较短,在30分钟内很快转变为无活性稳定的6-酮-PGF1α,后者在体内可经肝脏氧化代谢转变为去甲基6-酮-PGF1α,测定二者含量可间接反映内皮细胞合成PGI 2的多少。去甲基-6-酮-PGF1α比6-酮-PGF1α能更准确地反映体内PGI 2的生成水平,可作为反映血管内皮早期损伤的指标之一。通过竞争性ELISA或放射免疫分析( RIA)均可进行定量,但以前者更常用。

【临床意义】

6-酮-PGF1α减少见于糖尿病、动脉粥样硬化、急性心肌梗死、心绞痛、脑血管病变、肿瘤转移、周围血管血栓形成及血栓性血小板减少性紫癜( TTP)等。