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三、制备工艺
(一)相分离法
相分离法是制备药物微球或微囊的主要工艺之一。目前已知界面大小及膜的多孔性、扭曲度、厚度与结构等对质量都有影响，但此工艺仍然存在一些问题，如普遍存在的微球或微囊聚集和粘连问题。从目前的研究结果来看，相似的工艺所得微球或微囊在粒径分布范围及释放曲线方面有很大的差异，这说明工艺过程某些方面控制不严，或者是由于反应对有些条件过分敏感，这些条件的微小变化都可引起明显的效果差异。
1.基本原理
相分离法是在药物与材料的混合溶液中，加入另外一种物质或不良溶剂，使材料的溶解度降低，自溶液中产生一个新相（即凝聚相），这种制备微球或微囊的方法，称为相分离法，可分为单凝聚法、复凝聚法、溶剂-非溶剂法和改变温度法。相分离法制得的微粒直径一般在2～250μm之间。另外可以先用相分离法制备空白微粒，然后将药物用吸收或吸附的方法载入空白微粒。
（1）单凝聚法（simple coacervation）：
系采用一种高分子材料（如明胶或醋酸纤维素酞酸酯）加入凝聚剂（降低溶解度）使之凝聚成球/囊，这时凝聚相为高黏度、半流动的凝胶。凝胶是可逆的，一旦解除凝聚的条件，就会发生解凝聚而使微球或微囊消失。得到满意的微球或微囊后，通过固化成型即可。
（2）复凝聚法（complex coacervation）：
系使用两种带相反电荷的高分子材料作为复合材料，如明胶与阿拉伯胶、羟甲基纤维素或醋酸纤维素酞酸酯等多糖、海藻酸盐与聚赖氨酸、海藻酸盐与乙酰壳多糖、海藻酸与白蛋白、白蛋白与阿拉伯胶等（图7-3）。
图7-3 以明胶-阿拉伯胶为囊材的复凝聚法制备微球工艺流程图
（3）溶剂-非溶剂法（solvent-nonsolvent）
是在材料溶液中加入一种对材料不溶的溶剂（即非溶剂），引起相分离，而将药物包裹成球/囊。本法药物可以是固态或液态，但必须在溶剂和非溶剂中均不溶解，也不起反应。若使用疏水性材料，要用有机溶剂溶解，疏水性药物可与材料混合，若药物是亲水性的，不溶于有机溶剂，则可混悬或乳化于材料溶液中，加入争夺有机溶剂的非溶剂后使材料的溶解度降低而从溶液中析出，形成微球或微囊，分离，除去有机溶剂即得微球或微囊。
2.制备工艺
相分离法的工艺基本步骤可归纳为以下三步：
（1）在高分子材料溶液中，将药物溶解或分散成混悬液或乳状液。
（2）通过降低温度、调节pH或加入脱水剂、非溶剂等凝聚剂的方法，降低高分子的溶解度，使高分子材料从溶液中析出，形成新的凝聚液滴。
（3）固化成微球或微囊。
(二)液中干燥法
从乳状液中除去分散相——挥发性溶剂以制备微球或微囊的方法称为液中干燥法（inliquid drying），亦称溶剂挥发法。
1.工艺流程
液中干燥法的干燥工艺包括两个基本过程：溶剂萃取过程（两液相之间）和溶剂挥发过程（液相和气相之间）。按操作，可分为连续干燥法、间歇干燥法和复乳法。前两种方法多应用于O/W型、W/O型、O/O型乳状液，而复乳法则常应用于W/O/W、O/W/O型复乳。它们都要先制备高分子材料的溶液，乳化后材料溶液成为乳状液中的分散相，与连续相不宜混溶，但应注意材料溶剂在连续相中应有一定的溶解度，否则，萃取过程无法实现。在连续干燥法及间歇干燥法中，如果所用的材料溶剂也能溶解药物，则制得的是微球，否则得到的就是微囊，复乳法制得的一般都是微囊。
连续干燥法的基本工艺流程如图7-4所示。
图7-4 连续干燥法的基本工艺流程图
如材料的溶剂与水不混溶，则多用水作连续相，加入亲水性乳化剂（如极性的多元醇），可制成O/W型乳状液；也可用高沸点的非极性液体如液状石蜡作连续相，制成O/O型乳状液。如材料的溶剂能与水混溶，则连续相可用液状石蜡，加入油溶性乳化剂（如司盘80或司盘85），制成W/O型乳状液。根据以上连续相的不同，液中干燥法又可分别称为水中干燥法及油中干燥法。
用O/W型乳状液的连续干燥法，即将溶解有聚合物材料的有机溶液分散至药物水溶液中形成O/W型乳状液，在不断的搅拌下，有机溶剂挥发，形成聚合物微球或微囊。这种方法制备的微球或微囊，使亲水性强的药物容易从内油相中扩散至外水相中，致使载药量低、突释效应强。这种方法的缺点是所得微囊（球）表面常有药物的微晶体，这往往是造成突释的主要原因。如果控制干燥速率，使溶剂缓慢挥发，也可得到满意的微球或微囊。
采用间歇干燥法可明显减少药物微晶体的出现。其基本工艺流程与连续干燥法的差异在“连续蒸发除去材料的溶剂”这一步。如果连续相为水，将连续干燥法中的这一步改为“蒸发除去部分材料的溶剂-用水代替乳状液中的连续相进一步除去材料的溶剂”，最后分离得微囊（球），即为间歇干燥法。
在间歇干燥法工艺中，蒸发除去部分溶剂后，已初步形成微球或微囊，再用水代替连续相，水对材料的溶剂起迅速萃取作用，可使材料析出，从而在分散相与水的界面形成较坚固的薄膜，该膜可阻止分散相内的药物向外扩散，但尚容许材料的溶剂扩散，继续萃取材料的溶剂，这样药物便不易在界面析出微晶体，从而可以制得较为满意的微球或微囊。
若连续干燥法或间歇干燥法用水作连续相，则不宜制备水溶性药物的微球或微囊，因为微球或微囊中的药物易进入水相而降低药物包封率和载药量，此时可考虑不用水而改用O/O型乳状液。但是用O/O型乳状液药物却可能在微球或微囊表面形成微晶体，或者仍有药物进入连续相，因为所用亲油性乳化剂会增大水溶性药物在连续相中的溶解度。另外用O/O型乳状液可产生新的缺点，如所用的连续相在分离时未完全除尽，则所得微球或微囊的流动性就不会太好。而复乳法可克服以上缺点，W/O/W复乳法工艺流程见图7-5。
图7-5 W/O/W复乳法工艺流程图
复乳法也可用于油溶性药物，先制成O/W性乳状液，再分散在另一油相得O/W/O型复乳，蒸发除去水后，即可分离出具有水溶性膜的微球或微囊（图7-6）。
图7-6 O/W/O型复乳法制备微球或微囊示意图
2.工艺影响因素 （1）共同的影响因素：
在液中干燥法中主要应控制的因素就是在成囊（成球）过程中多种物质转移的速率和程度，通常需要考虑的影响因素见表7-3。
表7-3 液中干燥法影响成囊（球）的因素
续表
（2）制备O/W型乳状液的影响因素 1）挥发性溶剂：
一般应在水中微溶（溶解度＜10%），且正常沸点低于100℃，常用的有二氯甲烷、丙酮、三氯甲烷、氯乙烯、乙酸甲酯和乙醚等。
2）亲水型乳化剂：
它对维持O/W型乳状液的稳定性，及除去挥发性油相后所得微囊（球）是否满意，均有重大的影响。二氯甲烷作为挥发性溶剂时常用的乳化剂为聚乙烯醇（PVA）、海藻酸钠、油酸钠、吐温80及Pluronic F68等。在具体系统中应用哪一种乳化剂最好及其最佳用量，目前还处于试验阶段。
有人认为亲水亲油平衡值（HLB）值不低于10的亲水高分子、阴离子或非离子型的表面活性剂都可作为O/W型乳状液的乳化剂用于液中干燥法。但试验结果显示，明胶、阿拉伯胶或吐温20用于水相时，只能得到大量的粘连体或粗的聚集微球。
3）药物性质：
应用O/W型乳状液的液中干燥法已成功地将水溶性药物制成微球或微囊，但药物的包封率往往不太理想，损失在水相中的比例较大，可能是因为药物溶解于水，或者是因为在水相中药物结晶。具体影响因素包括单位质量的药物所用的水相的体积、在试验条件下药物在水相中的溶解度以及药物与所用载体材料的混溶能力等。
要降低药物在水相中的溶解度，可预先使在水相中溶解的药物达到饱和。也可以在水相中加入无机盐降低药物的溶解度。37%的（NH 4） 2 SO 4、30%的CaCl 2及饱和NaCl都曾被应用过。
（3）液中干燥法用于制备聚合酸酐微粒 1）形态：
液中干燥法所制得的聚酯微粒的形态是多种多样的。有的是表面光滑的完整圆球，有的表面粗糙或者呈多孔状结构，偶尔也可能是外形不规则的形状。还有的在表面有药物的微晶体出现或者表面多孔、内部多孔等。
影响微粒形态的因素有：聚合物的结晶度、药物含量、药物能否溶于挥发性溶剂中、药物与材料的互溶性、乳化剂的性质、挥发性溶剂被萃取及挥发的速率等。
有一定结晶性的聚合物易形成有孔的微粒， T g远高于室温的无定型聚合物常形成表面光滑的圆球，尤其是当药物含量不高，又以分子分散在微粒中时，更是如此。药物如果易溶解于挥发性溶剂而设计的含量超过20%时，所得微粒的表面或外形可能不规则，而如果药物含量超过50%时，则更难避免外形不规则，另外也易在表面形成药物的微晶体。溶剂挥发太快时，微球表面也易出现药物的微晶体。间歇干燥法可提高药物含量而减少表面出现药物微晶体或外形不规则的机会。如果挥发性溶剂除去太快，形成的微粒往往多孔。
2）药物存在的形式：
液中干燥法多用于固态药物的微囊化。如药物晶体不溶于溶剂而以混悬液形式存在，则药物结构不易变化。如药物易溶于挥发性溶剂而不溶于连续相，则在除去挥发性溶剂后药物往往会结晶，微晶体可在微球内、微球表面或连续相中生成。如药物与材料形成真溶液，或在材料中呈亚稳态分散，药物也可不结晶或仅有部分结晶。以上药物在微粒中的不同状态，对微粒的形态、包封率及药物的稳定性都有影响。
光学显微镜可检测连续相中及微粒表面有无药物微晶体形成，扫描电镜可测得微粒表面、裂缝及截面内的微晶体。热分析与X射线粉末衍射可测得药物晶型或储存后的变化。
聚合物与药物无相互作用且无溶剂存在时，聚合物的玻璃化转变温度（ T g）不会发生变化；药物能降低聚合物的 T g时，表明它与聚合物有亲和力；残留的溶剂也会明显降低聚合物的 T g。热分析法可确定聚合物 T g降低是由于同药物作用还是由于残留溶剂的存在，同时也可确定存在于微粒中的药物是平衡态结构还是亚稳态结构。故载药微粒特性的常规测定可用热分析。但由于热分析的加热过程可引起微粒结构的改变，所以通常将热分析与X射线粉末衍射结合使用。
3）聚酯微粒的释药特性：
释药特性除了可以用改变聚酯组成的化学法加以控制外，也受在制备过程中加入附加剂等物理方法的影响，如将微粒制成片剂，则释药特性还将受到压片时压力的影响。
4）聚酯微粒的降解：
聚酯在体内的降解通常断键的位置是不确定的，但酶对于断键的位置可能具有决定性作用。除聚酯的性质影响降解外，药物的量及性质、微粒的制备工艺及使用方法也会影响微粒的降解。
(三)喷雾干燥法
制备微粒的物理机械法有喷雾干燥法、喷雾冻结法、多孔离心法及锅包法等，其中以喷雾干燥法最常用。喷雾干燥是将液体成分在热气环境中雾化成小液滴再干燥成固体颗粒的过程。该技术在制药工业中用于干燥热不稳定药物，或用于改善水中溶解度较低药物的溶解性，改善制备片剂用颗粒的流动性，改善药物在高分子材料中的分散性，也可用于制备药物微囊。喷雾干燥技术是药物微囊化的一个有效方法，特别是对水溶液中成分的干燥，该方法简单实用。
喷雾干燥法又包括流化床喷雾干燥法（又称空气悬浮法）与液滴喷雾干燥法。其中流化床喷雾干燥法通常将囊材溶液从流化床的底板孔隙喷出，在流化室中心固定的开口圆筒内，喷在被向上气流吹动的固态囊心物上；在包裹粒径较小的囊心物时可改进为从顶上喷液，故利用该法制得的是微囊。喷雾干燥法比锅包法粘连较少，干燥较快。流化床工艺中使用的易燃有机溶剂有引起爆炸的危险，有时需要昂贵的防爆装置或将流化气惰性化（包括用燃烧排空、凝结或吸收的方法回收以免污染环境）。近年来，快速崩解膜、肠溶衣、缓释膜等几乎所有能控制释放的膜，都可由水溶液处方用流化床喷雾干燥法制备。流化床喷雾干燥法制得的微囊粒径范围一般为35～5000μm。
液滴喷雾干燥法可用于固态或液态药物的微囊化，粒径通常在600μm以下。其工艺流程是先将囊心物分散在材料的溶液中，再用喷雾法将此混合物喷入热气流使液滴干燥固化。如囊心物不溶于囊材溶液，可得到微囊；反之，可得微球。
(四)缩聚法
缩聚法系将单体或高分子通过聚合反应或缩合（交联）反应产生囊膜或基质，从而制成微囊或微球。
1.乳化缩聚法 （1）聚乙烯醇微球：
用不同浓度的戊二醛与聚乙烯醇（PVA）在含稳定剂的液状石蜡中制成W/O型乳状液，再用酸催化可得交联聚乙烯醇微球。
（2）淀粉微球：
以甲苯、三氯甲烷、液状石蜡为油相，司盘60为乳化剂，将20%的碱性淀粉分散在油相中，形成W/O性乳状液，然后升温至50～55℃，加入交联剂环氧丙烷适量，反应数小时后，去除油相，再分别用乙醇、丙酮多次洗涤干燥，得白色粉末球状微球，粒径范围为2～50μm。
2.界面缩聚法
界面缩聚法亦称界面聚合法，是先使连续相中的聚合物单体聚集在囊心物与连续相的界面上，然后单体再聚合成膜，或通过交联剂进行缩合反应在界面成膜。
（1）二胺或亚胺缩聚法：
例如，分散相中含有1，6-己二胺和碱（如硼砂），连续相是对二甲苯酰氯的环己烷三氯甲烷溶液，当两者相互混合搅拌时，1，6-己二胺和对二甲苯酰氯将在两相的界面上接触并迅速发生缩聚反应，所生成的聚酰胺几乎完全沉积于液滴界面，即包裹囊心物形成球状膜壳型微囊。由于上述缩聚反应在碱性条件下进行，所以只适用于对碱稳定的药物。
采用新的乳化技术可制备粒径分布很窄的聚酰胺微囊，即分散相用氮气加压通过管状的微孔玻璃膜（孔径分别为1120nm、720nm、520nm）成滴后，进入流动的分散介质中。分散相是含0.1mol/L二乙烯二胺、0.1mol/L碳酸钠、10g/L葡聚糖（T-500）及适量氯化钠的水溶液，分散介质则是含10%（体积分数）的山梨醇倍半油酸酯的环己烷溶液。在形成的W/O型乳状液中加入溶有0.2g对苯二甲酰氯的20ml混合溶剂（三氯甲烷∶环己烷=1∶4），使界面缩聚进行，离心5分钟，微囊用环己烷洗涤，在表面活性剂存在下转入水中，再用水反复洗涤即得。
一般用搅拌法得到的乳状液的跨距（表示粒径分散度的参数，跨距愈大粒径分布愈宽）约为0.75，而用上面的微孔玻璃膜技术制备的乳状液跨距仅为0.38，粒径范围2.2～6μm。
乳滴的平均粒径与膜的平均孔径呈直线关系，而与分散相的黏度、分散介质的组成、表面活性剂的类型和浓度（应使用HLB值较小的表面活性剂）无明显关系，但随着分散相中盐浓度的增大，乳滴平均粒径逐渐降低。当盐浓度达0.4mo1/L或更大时，乳滴粒径不再降低，但盐浓度达到0.8mo1/L以上时，乳滴的粒径又逐渐增大，微粒粒径也增大。
（2）蛋白质缩聚法：
蛋白质用苯二甲酰氯进行界面交联，可制备微囊。例如，将12ml人血清白蛋白（HSA）、小牛纤维蛋白原或卵白蛋白的溶液（pH=9.8），其中HSA和卵白蛋白浓度均为200g/L，小牛纤维蛋白原为60g/L，分别加到60ml混合溶剂中（三氯甲烷/环己烷，体积比1∶4），再加80ml苯二甲酰氯作为交联剂。搅拌30分钟后，加水稀释终止反应，将微囊用混合溶剂洗几次，使之混悬在混合溶剂中。再依次用2%聚山梨酯、95%乙醇溶液、95%乙醇和水洗涤。最后用碱性羟胺处理，将囊膜中的酯键和酸酐键裂解，即得微囊。
又如，天冬酰胺酶微囊的制备：取天冬酰胺酶及天冬氨酸溶于人体O型血红蛋白液（比酶更易与二甲酰氯反应并且结合到壁膜中）和pH=8.4硼酸盐缓冲溶液中，加1，6-己二胺碱性硼酸钠溶液，置反应瓶中，再加混合试剂（环己烷、三氯甲烷、司盘85，摇匀），置4℃冰浴搅拌，加入对苯二甲酰氯，继续搅拌，最后加入混合溶剂再搅拌，显微镜下观察已形成的微囊后，立即转入离心管中离心，倾去上清液，加入分散液（吐温20加蒸馏水），搅拌，加入蒸馏水再搅拌，倾去上清液，即得平均粒径20μm的微囊。
(五)低温喷雾提取法 1.基本原理
此种方法是较新的制备微球或微囊的方法，其操作为：将多肽及其稳定剂的粉末或冻干品和生物可降解聚合物的二氯甲烷溶液均匀混合，混悬液经喷头以雾状喷至冰冻的乙醇溶液中，后者界面封以液氮。在-70℃温度下，乙醇将微球中二氯甲烷不断抽提，最后经过滤除去乙醇，干燥待用。此方法药物包封率较高，但仪器复杂，成本昂贵。
其常用仪器设备为超声雾化-低温萃取（cryogenic process）装置。本装置微囊化原理分四个步骤：①药物分散于适当溶剂形成乳状液（或混悬液）；②乳状液（或混悬液）超声雾化；③冷冻条件下乳状液（或混悬液）扩散入冷冻介质中，药物及载体析出成囊；④分离包载药物的微囊，干燥。其装置见图7-7。
图7-7 雾化-低温萃取制备蛋白质、多肽微球或微囊示意图
2.实例
传统的W/O/W方法制备的重组人生长激素（rhGH）微球易导致蛋白质多肽药物的多相释放，且突释比较严重。而运用新型的低温萃取工艺可实现rhGH的持续释放且突释较小。首先将rhGH∶锌（6∶1）形成的不溶性复合物冻干，然后混悬在PLGA的二氯甲烷溶液中，超声分散后，经超声雾化喷至液氮保护下冷却至-80℃的乙醇中，rhGH在该超冷环境中十分稳定，微乳中的二氯甲烷很快被乙醇所萃取，rhGH-PLGA微球析出，最后经真空过滤、干燥得成品。该设备工艺简单、重现性好，美国Sono-Tek公司已有批量达几百克微球规模的装置，由其中试装置和实验室装置制备的产品均有较好的重现性。
也有学者对超声雾化-低温萃取成囊工艺与复乳-液中干燥工艺进行了多项指标的比较，结果表明前者具有药物包封率高、突释效应较低等优点。
(六)超临界流体技术 1.原理与特性
物质达到一定的临界温度和临界压力以上形成的流体称为超临界流体（supercritic fluid，SCF）。SCF兼有气体和液体的优点，其特殊的物理性质使SCF成为一种优良的溶剂，其特性包括：①具有良好的溶解、渗透性能，表面张力远远低于液体；②介电常数：随压力急剧增大，有利于溶解低挥发性物质；③密度与液体相近，比一般气体大两个级别，有利于溶质的相转移，在临界点附近，温度、压力的微小变化能使其密度发生显著变化，有利于人为控制条件，得到预期特性颗粒；④黏度比液体小一个数量级，扩散系数比液体大两个数量级，类似于普通气体，因而有较好的流动性和传质性。
超临界流体技术基本原理：在SCF形成的条件下，使溶质充分溶解成饱和溶液，降低压力，致过饱和，使溶质微粒均匀成核，制备出的微粒具有粒径分布窄、结晶度高、表面圆整等特点，同时还能提高药物的化学纯度，降低溶剂残留量。由于SCF具有巨大的可压缩性，以通过调节压力、温度，方便对溶液的过饱和度进行调节，以控制粒径尺寸在一定的范围内。另外，通过控制不同的生产条件，微粒的晶型纯度也能达到很高水平。
2.超临界流体技术制备微球或微囊的分类与方法
超临界流体技术（SCF）制备微球或微囊常用的方法有两种：超临界溶液快速膨胀过程（rapid expansion of supercritical solution，RESS）和超临界反溶剂过程（supercritical antisolution，SAS）。SAS法又可分为：气体反溶剂法（gas antisolution，GAS）、气溶胶溶剂萃取法（aerosol solvent extraction system，ASES）、SCF提高溶液分散法（solution-enhanced dispersion by supercritical fluids，SEDS）等。
超临界溶液快速膨胀过程（RESS）是SCF经过微细喷嘴的快速膨胀过程，适用于任何能形成超临界溶液的溶剂-溶质体系。该法是将溶质直接溶于超临界流体（SCF）中形成的超临界溶液体系，在膨胀过程中，压力、温度的突然降低使溶质溶解度降低，形成过饱和溶液，析出大量微球或微囊。由于此过程在瞬间完成，因此整个流体均匀成核，形成平均粒径小而均匀的微球或微囊。
气体反溶剂法（GAS）是将溶质先溶解在某种有机溶剂中，然后将此溶液与SCF混合。由于有机溶剂可溶于SCF而溶质不溶，于是溶质析出形成微球或微囊。由于液态CO 2可溶解于有机溶媒中，故先将药物与高分子材料溶解在有机溶媒中，当将此溶液与液态CO 2混合后，载有药物的高分子材料则析出形成微球或微囊。溶液和反溶剂的接触可通过梯度添加SCF到溶液中称为GAS法，或者借助喷嘴将溶液喷入流动的反溶剂中称为气溶胶溶剂萃取法（ASES）。由于通常作为反溶剂的CO 2不能与水互溶，因此上述GAS和ASES法均不能溶于含水的体系而发展了SEDS法。SEDS是将水溶液与SCF通过同轴的喷嘴同时引入，使溶液与流体高度混合，一并喷入微球或微囊生成器制得微球或微囊。
超临界流体技术（SCF）是最近发展起来的一门新兴技术，在颗粒和微球或微囊制备方面的应用正处于研究开发阶段，其主要优点有以下几个方面：①使用的SCF-CO 2污染性小，安全性高；②生产温度较低，适用于包载基因工程药物的缓控释微球或微囊的制备；③制剂工艺可重复。