基因工程药物研究与应用
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五、等电点测定

蛋白质的氨基酸组成不同,因而有不同的等电点(pI),等电点是测定重组蛋白生产工艺稳定性的重要指标。常用的等电点测定方法有等电聚焦电泳(IEF)及毛细管电泳(CE)。其中前者为药典法定方法。

(一)等电聚焦电泳(IEF)

依据各种蛋白质pI不同,以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物,并在其中加入两性电解质载体。两性电解质载体在电场作用下,按各自pH形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作用下,蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动,当迁移至pH等于pI处时,不再泳动,电流达到最小,而被浓缩成狭窄的区带。根据标准品的pI对其相应的迁移距离作直线回归,将供试品的迁移距离代入直线回归方程,即可求得蛋白的等电点。

(二)毛细管等电聚焦电泳(CIEF)

毛细管等电聚焦电泳,是通过内壁涂层使电渗流减到最小,再将样品和两性电解质混合进样,两个电极槽中分别为酸和碱,加高电压后,在毛细管内建立了pH梯度,溶质在毛细管中迁移至各自的等电点,形成明显区带,聚焦后用压力或改变检测器末端电极槽储液的pH使溶质通过检测器。具有分辨率高、简便快速等特点。