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三、昆虫杆状病毒表达体系
昆虫表达系统建立于1983年,利用苜蓿银纹夜蛾核型多角体杆状病毒作为外源基因的表达载体转染昆虫草地贪夜蛾的一个细胞系,用于人干扰素β的生产。此后,由于杆状病毒具有启动子序列;在哺乳动物细胞内没有活性;对脊椎动物无传染性;能同时克隆多个外源基因;悬浮培养的昆虫细胞可增殖到很高的滴度;多数表达的蛋白在昆虫体内能保持可溶状态;重组体杆状病毒在自然界生存短暂从而可以保证生物安全等优点,使该系统发展迅速,建立了当今比较流行的重组杆状病毒表达系统和昆虫细胞稳定转化表达系统,在重组蛋白表达生产工程疫苗和蛋白质组学研究等领域得到越来越多的应用。
(一)优点
昆虫细胞表达体系以昆虫细胞为表达宿主,较多采用草地贪夜蛾细胞sf9、sf21等。此外也采用家蚕幼虫进行表达。该体系主要表达载体是昆虫杆状病毒载体,由苜蓿核型多角病毒和家蚕核型多角病毒的多角体蛋白基因强启动子构建获得。这类载体的优点如下:①具有完整的感染性:昆虫病毒载体的重组区是基因组的非必需区,即使缺失也不会影响病毒的复制和表达,保持了昆虫杆状病毒载体的完整感染性;②容量大:由于昆虫杆状病毒的包含体蛋白可以延伸,因此容纳外源DNA能力大,可达100kb;③标记显著:在包含体蛋白基因区插入外源基因后,失去了包含体蛋白的空斑,较易辨认;④表达产物可以被分泌表达;⑤表达水平较高:外源基因置于多角病毒蛋白启动子控制下,由于启动子强,使外源蛋白表达量可达细胞总蛋白的50%,最高的可达几毫克;⑥能有效进行翻译后加工,可糖基化;⑦宿主严格,对脊椎动物和植物无害,安全性好;⑧细胞可连续传代,25~30℃培养无须CO 2;⑨可悬浮培养,适于规模化。
(二)不足
2007年,第一个由昆虫细胞生产的抗人乳头瘤病毒疫苗在英国葛兰素史克公司获得生产许可。然而,昆虫表达系统也存在一些弊端。有研究表明,昆虫细胞内表达的外源蛋白经常在富含Arg/Lys的序列位点被蛋白内切酶切割,形成没有活性的蛋白表达产物,而且其糖基化修饰仅限于高甘露糖型寡糖链,不能形成包含果糖、半乳糖和唾液酸的复杂寡糖链结构,因此糖基化水平低成为该系统的主要缺陷。如果在重组产物纯化过程中混有昆虫细胞的蛋白,则可能在应用时引起过敏反应。所以,如何进一步纯化表达产物,将其致敏原性降到最低限度是值得重视和探讨的问题。