外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5'磷酸和相邻的3'羟基之间形成的新的共价键。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯键。但如果质粒DNA已去磷酸化，则只能形成2个新的磷酸二酯键。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有2个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的5'磷酸和3'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠埃希菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。实际上在载体连接反应中，T4噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。因为它能有效地将平端DNA片段连接起来。

DNA一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的DNA末端的浓度决定。不论末端位于同一DNA分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种DNA，也就是用可产生黏端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体DNA，再加作用的底物。如果反应中DNA浓度低，则配对的两个末端同一DNA分子的机会较大（因为DNA分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同DNA分子的末端的概率）。这样，在DNA浓度低时，质粒DNA重新环化将卓有成效。如果连接反应中DNA浓度有所增高，则在分子内连接反应发生以前，某一个DNA分子的末端碰到另一DNA分子末端的可能性也有所增大。因此在DNA浓度高时，连接反应的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。Dugaiczyk等从理论上探讨了DNA浓度对连接产物性质的影响。简而言之，环化的连接产物与多联体连接产物的比取决于两个参数：j和i。j是DNA分子的一个末端在同一分子的另一末端附近的有效浓度，数值是根据如下一种假设作出的：沉吟液中的DNA呈随机卷曲。这样，j与DNA分子的长度成反比（因为DNA越长，某一给定分子的两末端越不可能相互作用），因此j对给定长度的DNA分子来说是一个常数，与DNA深度无关。j=［3/（3πlb ₀）］3/2，其中l是DNA长度，以厘米（cm）计，b是随机卷曲的DNA区段的长度。b的值以缓冲液的离子强度为转移，而后者可影响DNA的刚度。i是溶液中所有互补末端的深度的测量值。对于具有自身互补黏端的双链DNA而言，i=2NoM×10 ^-3末端/ml。这里No是阿佛加德罗常数，M是DNA的摩尔浓度（单位：mol/L）。理论上，当j=i时，给定DNA分子的一个末端与同一分子的另一末端，以及与不同分子的末端相接触的可能性相等。因而在这样的条件下，在反应的初始阶段中，环状分子与多联体分子的生成速率相等。而当j＞i时，有利于重新环化；当i＞j，则有利于产生多联体。DNA区段的大小与连接反应混合物中j∶i之比分别为0.5、1、2和5时所需DNA浓度之间关系（Dugaiczyk等，1985）。现在考虑如下的连接反应混合物：其中除线状质粒之外，还含有带匹配末端的外源DNA片段。对于一个给定的连接混合物而言，产生单体环状重组基因组的效率不仅受反应中末端的绝对浓度影响，而且还受质粒和外源DNA末端的相对浓度的影响。当i是j的2～3倍（即末端的绝对浓度足以满足分子间连接的要求，而又不致引起大量寡聚体分子的形成时）时，有效重组体的产量可达到最大。这些条件下，连接反应终产物的大约40%都是由单体质粒与外源DNA所形成的嵌合体。

涉及带黏端的线状磷酸化质粒DNA的连接反应包含：①足量的载体DNA，以满足j∶i＞1和j∶i＜3。对一个 pUC18一般大小的质粒，这意味着连接反应中应含有载体 DNA为20～60μg/ml。②末端浓度等于或稍高于载体DNA的外源DNA，如外源DNA浓度比载体低得多，在有效连接产物的数量会很低，这样就很难鉴别小部分带重组质粒的转化菌落。这种情况下，可考虑采用一些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。如用磷酸酶处理线状质粒DNA以便通过定向克隆的方法构建重组质粒。

1.用适当的限制酶消化质粒和外源DNA。如有必要，可用凝胶电泳分离片段和（或）用碱性磷酸酶处理质粒DNA。通过酚∶三氯甲烷抽提和乙醇沉淀来纯化DNA，然后用TE（pH7.6）溶液使其浓度为100ng/ml。

2.按如下所述设立连接反应混合物

（1）将0.1μl载体DNA转移到无菌微量离心管中，加等摩尔量的外源DNA。

（2）加水至7.5μl，于45℃加温5分钟以使重新退火的黏端解链，将混合物冷却到0℃。

（3）加入：10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液1μl；T4噬菌体DNA连接酶0.1Weiss单位；5mmol/L ATP 1μl。于16℃温育1～4小时。其中10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液包括：200mmol/LTris.Cl（pH7.6）、50mmol/LMgCl ₂、50mmol/L二硫苏糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白（组分Ⅴ，Sigma产品）（可用可不用），该缓冲液应分装成小份，贮存于-20℃。

另外，再设立两个对照反应，其中含有：①只有质粒载体；②只有外源DNA片段。如果外源DNA量不足，每个连接反应可用50～100ng质粒DNA，并尽可能多加外源DNA，同时保持连接反应体积不超过10μl。可用至少3种不同方法来测定T4噬菌体DNA连接酶的活性。大多数制造厂商（除New England Biolabs公司外）现在都用Weiss等对该酶进行标化。1个Weiss单位是指在37℃下20分钟内催化1mmol 32P从焦磷酸根置换到［γ，β-32P］ATP所需酶时，1个Weiss单位相当于0.2个用外切核酸酶耐受试验来定义的单位（Modrich和Lehman，1970）或者60个黏端单位（如New England Biolabs公司所定义）。因此，0.015Weiss单位的T4噬菌体DNA连接酶在16℃下30分钟内可使50%的λ噬菌体HindⅢ片段（5μg）得以连接。在本书中，T4噬菌体DNA连接酶一律用Weiss单位表示。目前提供的T4噬菌体DNA连接酶均为浓溶液（1～5U/μl），可用20mmol/L Tris.Cl（pH7.6）、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫苏糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50%甘油稀释成100U/ml的浓度置存。处于这种浓度并在这种缓冲液中的T4噬菌体DNA连接酶于-20℃保存3个月可保持稳定。③每个样品各取1～2μl转化大肠埃希菌感受态细胞。

T4噬菌体DNA连接酶不同于大肠埃希菌DNA连接酶，它可以催化平端DNA片段的连接（Sgaramella和Khorana，1972；Sgaramella和Ehrlich，1978），由于DNA很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性，才能使任何DNA分子彼此相连。然而，相对而言，平端连接是低效反应，它要求以下4个条件：①低浓度（0.5mmol/L）的ATP；②不存在亚精胺一类的多胺；③极高浓度的连接酶（50Weiss单位/m l）；④高浓度的平端。