第二篇　基因工程药物研究技术与质量控制

目前，基因工程药物的研究热点主要有基因工程疫苗、反义RNA、三链DNA。

基因工程疫苗指的是DNA疫苗，即将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的质粒上，然后将质粒直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。抗原基因在一定时限内的持续表达，不断刺激机体免疫系统，使之达到防病的目的。基因工程疫苗，目前主要应用于传统疫苗无法对付的病毒性疾病和恶性疾病，如艾滋病、乙型病毒性肝炎、癌症等疾病的治疗和预防。世界上第一例基因疫苗是用于治疗艾滋病的HIV基因疫苗，1996年批准在健康人身上进行预防艾滋病的基因疫苗的Ⅰ期临床试验。乙肝病毒表面抗原基因疫苗、包膜蛋白基因疫苗均可诱发机体产生免疫应答。基因疫苗还被用于其他病毒性疾病的预防，如单纯疱疹病毒、狂犬病病毒、丙型肝炎病毒感染等。

反义RNA指与mRNA互补后，能抑制与疾病发生直接相关基因表达的RNA。它封闭基因表达，具有特异性强、操作简单的特点，可用来治疗由基因突变或过度表达导致的疾病和严重感染性疾病。反义RNA目前主要用于恶性肿瘤、病毒感染性疾病等。用反义K-ras封闭胰腺癌、肺癌的 K- ras癌基因，对癌细胞具有明显的抑制作用。反义RNA对麻疹病毒也有显著的拮抗作用。

三链DNA脱氧寡核苷酸能与双螺旋双链DNA专一性序列结合，形成三链DNA，来阻止基因转录或DNA复制，此脱氧寡核苷酸被称为三链DNA形成脱氧寡核苷酸（TFO）。为了与作用在mRNA翻译水平的反义RNA的反义技术相区别，将三链DNA技术称之为反基因技术。其基本方法与机制为：设计合成15～40个碱基的脱氧寡核苷酸，按TAT、C＋GC、GGC、A（AT）三碱基体规律与双链DNA结合，通常结合在蛋白识别位点处，形成三链DNA，干扰DNA与蛋白质的结合，如转录激活因子，从而阻止基因的转录与复制。由于TFO的稳定性问题没解决，故其应用研究尚处于试验阶段，如抑制淋巴瘤的 bcl- 2基因、乳腺癌的 HER2基因。

基因工程的原理是选择合适的外源目标DNA，然后通过体外操作将其整合到载体上，通过载体转入宿主细胞中，并成功地在宿主细胞内稳定遗传和高效表达。整个技术涉及生物化学、分子生物学、细胞生物学和生物工程学等学科，基因工程菌的构建过程可简单地分为以下几个步骤：①选择合适的外源物种作为供体，通过物理或酶切的方法将供体DNA切割成合适大小的片段，通过杂交等技术从供体细胞里分离出目的DNA片段，或者直接采用PCR技术体外克隆目标DNA片段；②利用连接酶将外源DNA片段连接到可在宿主细胞内复制和表达的载体上，并在载体上进行相关的改造，如改变或优化启动子，根据宿主细胞密码子的利用偏好性改造目标片段的碱基组成；③然后采用物理或化学的方法将载体转入宿主细胞或整合到宿主细胞染色体上；④进行基因工程菌的筛选和鉴定工作，选择合适的目标菌株；⑤通过培养，对目的菌株的表达特性、外源基因的遗传稳定性及安全性进行考察，最后确定合适的基因工程菌株，用于进一步的研究或开发。