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第三节 真菌感染的实验室检查与诊断
肺真菌病是最常见的深部真菌病。近年来由于广谱抗菌药物、糖皮质激素、细胞毒药物及免疫抑制剂的广泛使用，器官移植的开展，以及免疫缺陷病如艾滋病增多，肺真菌病有增多的趋势。
肺真菌病临床表现、影像表现等无特异性，诊断时必须综合考虑宿主因素、临床特征。病原菌不同，基础病不同临床表现各异。
一、肺念珠菌病
念球菌属中常见的致病菌为白色念球菌，多经组织和血流侵入，是条件致病感染中最常见的病原菌。
（一）临床表现 1.症状
①念珠菌支气管炎：阵发性刺激性咳嗽，咳多量似白泡沫塑料状稀痰，偶带血丝，随病情进展，痰稠如干糨糊状。喘憋、气短，尤以夜间为甚；乏力、盗汗，多不发热。②念珠菌肺炎：临床表现为畏寒、高热，咳白色泡沫黏痰，有酵臭味，或呈胶冻状，有时咯血，临床酷似急性细菌性肺炎。
2.体征
①念珠菌支气管炎：可发现口腔、咽部及支气管黏膜上被覆散在的点状白膜，胸部偶可闻及干性啰音。②念珠菌肺炎：轻症患者很少有阳性体征。病变广泛或病情严重患者可有肺实变改变，可闻及湿啰音。
（二）念珠菌感染的实验室检查和辅助检查 1.血液检查
血清念珠菌特异IgE抗体测定有助于诊断，通常在感染14天后血清中出现血清沉淀素，是一项比较敏感的检测方法。
2.病原学检查
临床常见的查到菌丝为假丝酵母菌、曲霉等。
（1）痰涂片及真菌培养检查：
涂片直接镜检简便、迅速，但阳性率低，阴性结果也不能排除真菌感染，需要区别是寄殖还是感染，并需要通过培养来鉴定菌种。但培养耗时较长，且漏诊率高。健康人痰中可查见念珠菌。诊断肺念珠菌病，要求连续3次以上痰培养有念珠菌生长，涂片查见菌丝，或经动物接种证明有致病力。为排除寄生于咽喉部念珠菌污染，留痰标本时应先用3%过氧化氢溶液含漱数次，弃去前两口痰，取以后的痰标本，立即送培养。亦可取经支气管镜或气管导管吸出液送检。应注意痰液不宜在室温下存放太久，否则亦可能有菌丝体生长。需要特别注意的是痰培养，如果有念珠菌生长，而临床没有相应的表现，则寄生的可能性极大，不能作为治疗的依据，循证医学的结果提示真正的念珠菌肺炎少见。
（2）经支气管镜或皮肺穿刺活检：
通过CT等影像学技术定位并引导行细针穿刺抽吸、活检的阳性率能达到60%。肺穿刺涂片或穿刺组织可同时获得病理和微生物学依据，只要从穿刺涂片或组织中发现真菌即可明确诊断为侵袭性感染。
3.影像学检查
念球菌感染常伴有细菌感染，病变分为血行分布和气道分布。CT片上呈结节状，周边有晕征，多为结节影，很少有空洞形成。经气道分布的病变，则多呈支气管肺炎影像。支气管-肺炎型见两中下肺野弥漫性斑片状、小片状阴影。支气管炎型在X线上大多无异常表现，或仅有两下肺纹理增粗。肺炎型则呈大量小片状或大片状阴影，甚至有脓肿形成。
（三）诊断
确诊需要组织学诊断和微生物学诊断。诊断依据：①有念珠菌感染高危因素；②咳嗽、咳白色黏液痰或脓痰，痰多呈胶冻样、黏稠，可抽出长丝，偶带血丝；③口咽部见覆盖点状白膜，肺部可闻及干湿啰音；④胸片、CT可见小片状或斑点状阴影，部分可重合；⑤痰连续多次培养出同一菌种念珠菌或直接镜检发现大量假菌丝或菌丝和成群芽胞；⑥环甲膜穿刺吸引或纤支镜取下呼吸道分泌物、肺组织、胸腔积液等培养出念珠菌；⑦肺组织病理学阳性。
二、肺曲霉病
过敏性支气管肺曲霉病（allergic bronchopulmonary aspergillosis，ABPA）、曲霉球和侵袭性肺曲霉病（invasive pulmonary aspergillosis，IPA）是最常见的3种类型。
（一）临床表现
ABPA：患者喘息、畏寒、发热、乏力、刺激性咳嗽、咳棕黄色脓痰，偶带血。曲霉球：可有刺激性咳嗽，常反复咯血，甚至发生威胁生命的大咯血。因曲霉肿与支气管多不相通，故痰量不多。IPA：症状以干咳、胸痛常见，部分患者有咯血，病变广泛时出现气急和呼吸困难，甚至呼吸衰竭。
（二）感染的实验室检查和辅助检查 1.血液检查 （1）G实验：
即1,3-β-D葡聚糖检测实验。
由于1,3-β-D葡聚糖仅广泛存在于真菌的细胞壁中，当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞吞噬、消化等处理后，1,3-β-D葡聚糖可从胞壁中释放出来，从而使血液及其他体液（如尿、脑脊液、腹腔积液、胸腔积液等）中其含量增高，当真菌在体内含量减少时，机体免疫可迅速清除1,3-β-D葡聚糖。而在浅部真菌感染中，1,3-β-D葡聚糖未被释放出来，故其在体液中的含量不增高。其在DFI诊断中意义重大，常见的病原菌为曲霉菌属和假丝酵母菌属，通过葡聚糖水平测定都可以检测出来，检测1,3-β-D葡聚糖只能提示有无真菌的侵袭性感染，但不能确定为何种真菌，这是此方法的缺陷。
临床工作中，深部真菌感染患者血浆葡聚糖水平的检测也有其局限性：
①假阳性：多种因素可导致G试验假阳性结果：污染（无热原的试管、枪头等受污染）；标本暴露于纱布或其他含有葡聚糖的材料；静脉输注免疫球蛋白、清蛋白、凝血因子或血液制品；某些细菌（尤其是链球菌）导致的败血症；使用多糖类抗癌药物如香菇多糖；黏膜损伤导致食物中的葡聚糖或定植的念珠菌经胃肠道进入血液等；服用多黏菌素B、厄他培能、头孢噻肟、头孢吡肟、舒他西林、磺胺等药物。在长期血液透析的患者，如果透析膜中含有葡聚糖成分可能出现假阳性的现象。②假阴性：隐球酵母菌属具有厚壁胞膜在免疫缺陷患者体内生长缓慢，导致试验呈假阴性。
（2）GM实验：
即半乳甘露聚糖检测实验。半乳甘露聚糖是曲霉细胞壁的成分之一，当曲霉侵袭组织可释放入血。对中性粒细胞缺乏宿主的侵袭性曲霉感染，GM检测的敏感度和特异度均较高，有重要辅助诊断价值，特别是GM＞1.0或随访呈现进行性升高者。但由于多种曲霉细胞壁上均存在GM，GM检测不能区分曲霉菌种。
2.血清学抗体检测
血清曲霉特异性IgE或IgG抗体阳性是诊断变应性支气管肺曲霉病(ABPA)的重要诊断依据，但由于侵袭性真菌感染的患者大多处于免疫抑制状态，不能产生有效抗体或抗体滴度很低而不能检测出，或急性感染的病情早期尚未产生抗体，因此抗体检测在急性侵袭性真菌感染中没有实际的诊断价值，多用于回顾性研究。
3.影像学检查 （1）ABPA：
机体对曲霉菌的变应性反应主要是Ⅰ型和Ⅲ型变态反应，临床上表现为哮喘样症状。胸部X线影像可见中枢性支气管扩张。CT上ABPA的中枢性支气管扩张多表现为囊性或静脉瘤状，支气管内常见有黏液栓形成，亦可见浸润影和肺不张。黏液栓的形成也可发生于其他疾病，如支气管扩张症、原发性纤毛功能不全综合征等，需注意与ABPA鉴别。
（2）曲霉球：
多由曲菌侵入结核的残存空洞、扩张的支气管或肺大泡内增殖形成菌球(fungus ball)所致，其在免疫状态正常的患者中有时亦可形成。普通的X线胸片可见空洞内有圆形或类圆形的阴影，空洞的一部分或大部分被菌球占据，空洞与菌球的间隙可见半月型的透亮区，即所谓的半月征（见图3-3-1）。菌球可随体位改变而变化是这一症候的特点。
（3）IPA：
主要见于免疫力低下的患者，病死率高。早期诊断无疑会提高治愈率，但IPA痰检阳性率低，细胞组织学诊断在临床上也很难实施，因此影像学诊断显得尤为重要。曲菌在肺部主要有两种侵袭方式：血管侵袭(angioinvasive)和气道侵袭(airway-invasive)，血管侵袭多见。血管侵袭的早期病变在胸部X线影像上表现为孤立或多发的结节浸润影，但有1/4的患者在普通X线片上很难读出，往往需CT方能看到IPA。IPA病变早期，CT片可见斑块状、结节状或局限性的浸润影，周边伴有磨玻璃样的阴影，即晕征(halo sign)（见图3-3-2）。此种影像也可见于念球菌病、Wegener肉芽肿、血管肉瘤转移等。随着病变的进展，中心坏死灶与周边分离的肺泡有气体进入形成半月征，此种改变通常在感染2～3周后发生。IPA的气道侵袭型比较少见，CT片可见小叶中心性点状阴影或支气管周围的浸润阴影。
图3-3-1 曲霉球CT表现
图3-3-2 侵袭性肺曲菌病CT表现
三、肺隐球菌感染
新生隐球菌属于酵母菌，广泛存在于自然界。肺隐球菌感染多由吸入环境中的新生隐球菌引起。此病多发于免疫抑制宿主，如艾滋病患者，但是约20%也可发生在免疫功能正常的健康人。
（一）临床表现
肺隐球菌病临床症状轻重不一，可毫无症状；轻者可有发热，干咳，偶有少量咯血，乏力，体重减轻；重症患者有气急和低氧血症。
（二）感染的实验室检查和辅助检查
乳胶凝集试验：荚膜多糖抗原为隐球菌厚荚膜中特异性成分，临床上常用乳胶凝集试验来检查血、脑脊液中隐球菌荚膜多糖抗原，准确率高、快速简便，可作为隐球菌性脑膜炎和隐球菌肺炎的早期诊断方法，并且可通过动态观察抗原的量来判断疗效和预后，脑膜炎患者脑脊液的阳性率超过90%，血清阳性率为75%左右。合并脑膜炎者，脑脊液墨汁染色涂片镜检发现隐球菌有助于诊断。
（三）影像学检查
原发性肺隐球菌病临床多无症状，胸部异常阴影常在体检时被发现，多呈局部病变，往往需同周边性肺癌和肺结核相鉴别。在CT片上，肺隐球菌病多呈孤立的或多发的结节影或肿块影，边界多较清，边缘不整，多伴有胸膜嵌入征及播散病灶，周边可有磨玻璃样阴影；也可见浸润影，表现为多发阴影的病例，多发生在同一肺叶内或下叶的胸膜下。继发性隐球菌病多有临床症状，但多较轻。与原发性隐球菌病不同，继发性隐球菌病肺部影像示结节影多呈融合的浸润状态，空洞和胸腔积液发生的频率较高。继发性肺隐球菌病胸部偶可见粟粒状和广泛浸润的影像表现。
四、肺孢子菌感染
肺孢子菌（pneumocystis），既往称其为卡氏肺囊虫（ Pneumocystis carinii, PC），目前已归属于真菌。PC引起的肺部感染称为卡氏肺囊虫肺炎，即肺孢子菌肺炎（ Pneumocystis carinii pneumonia，PCP）。多见于免疫缺陷者，偶见于健康者。化疗或器官移植患者并发PCP时进展迅速，而艾滋病患者并发PCP时进展较缓慢。
（一）临床表现 1.症状
PCP多见于免疫缺陷者，偶见于健康者。化疗或器官移植患者并发PCP时病情进展迅速，而艾滋病患者并发PCP时进展较缓慢。初期表现有食欲不振、体重减轻；继而出现干咳、发热、发绀、呼吸困难，很快发生呼吸窘迫。
2.体征
体征无特异性，轻症患者可无明显阳性体征，病变广泛者可有肺实变体征，及肺部闻及干湿性啰音。病变范围大影响呼吸功能者有发绀、呼吸困难等表现，有原发病相应体征。
（二）感染的实验室检查和辅助检查 1.血液检查
卡氏肺孢子菌检测：可用痰或诱导痰标本，纤维支气管镜刷检、经支气管肺活检、支气管肺泡灌洗、经皮肺穿刺和开胸肺活检等，标本染色观察包囊壁、囊内结构和滋养体。使用基因扩增技术较常规染色方法可明显提高诊断的敏感性和特异性。
2.影像学检查
胸部X线检查早期典型改变为双侧肺门周围弥漫性渗出，呈网状和小结节状影，然后迅速进展成双侧肺门的蝶状影，呈肺实变，可见支气管充气征。CT表现多呈双肺广泛弥漫性的磨玻璃样影像（见图3-3-3），而真菌感染此种影像则很少见。
图3-3-3 肺孢子菌肺炎CT表现
五、真菌的诊断
由于肺真菌病临床表现、影像表现等无特异性，诊断时必须综合考虑宿主因素、临床特征、微生物学检查和组织病理学资料，病理学诊断仍是肺真菌病（invasive pulmonary fungal infections，IPFI）的金标准。诊断IPFI分确诊、临床诊断及拟诊3个级别。
（一）确诊
要确诊侵袭性真菌感染，需至少符合1项宿主因素，肺部感染的1项主要或2项次要临床特征及下列1项微生物学或组织病理学依据：
1.霉菌
肺组织标本用组织化学或细胞化学方法检出菌丝或球形体(非酵母菌的丝状真菌)，并发现伴有相应的肺组织损害。肺组织标本、胸液或血液霉菌培养阳性，但血液中的曲霉菌属和青霉属(除外马尼菲青霉)真菌培养阳性时需结合临床，要排除标本污染。
2.酵母菌
肺组织标本用组织化学或细胞化学方法检出酵母菌细胞和(或)假菌丝。肺组织标本、胸液或血液酵母菌培养阳性，或经镜检发现隐球菌。
3.肺孢子菌
肺组织标本染色、支气管肺泡灌洗液或痰液中发现肺孢子菌包囊、滋养体或囊内小体。
（二）临床诊断
至少符合1项宿主因素，肺部感染的1项主要或2项次要临床特征及1项微生物学检查依据。
（三）临床拟诊
至少符合1项宿主因素，肺部感染的1项主要或2项次要临床特征。
附：侵袭性真菌感染诊断指南的摘编
宿主因素：
（1）外周血中性粒细胞减少，中性粒细胞计数＜0.5×10 9/L，且持续＞10d；
（2）体温＞38℃或＜36℃，并伴有以下情况之一：①之前60d内出现过持续的中性粒细胞减少(＞10d)；②之前30d内曾接受或正在接受免疫抑制剂治疗；③有侵袭性真菌感染病史；④患有艾滋病；⑤存在移植物抗宿主病的症状和体征；⑥持续应用类固醇激素3周以上；⑦有慢性基础疾病，或外伤、手术后长期住ICU，长期使用机械通气，体内留置导管，全胃肠外营养和长期使用广谱抗生素治疗等。
临床特征： （1）主要特征：
侵袭性肺曲霉感染的胸部X线和CT影像学特征为早期出现胸膜下密度增高的结节实变影，数天后病灶周围可出现晕轮征，约10～15d后肺实变区液化、坏死，出现空腔阴影或新月征；肺孢子菌肺炎的胸部CT影像学特征为两肺出现毛玻璃样肺间质病变征象，伴有低氧血症。
（2）次要特征：
①肺部感染的症状和体征；②影像学出现新的肺部浸润影；③持续发热96h，经积极的抗菌治疗无效。
微生物学检查：
①合格痰液经直接镜检发现菌丝，真菌培养2次阳性(包括曲霉属、镰刀霉属、接合菌)；②支气管肺泡灌洗液经直接镜检发现菌丝，真菌培养阳性；③合格痰液或支气管肺泡灌洗液直接镜检或培养新生隐球菌阳性；④支气管肺泡灌洗液或痰液中发现肺孢子菌包囊、滋养体或囊内小体；⑤血液标本曲霉菌半乳甘露聚糖抗原(GM)(ELISA)检测连续2次阳性；⑥血液标本真菌细胞壁成分1,3-β-D葡聚糖抗原(G试验)连续2次阳性；⑦血液、胸液标本隐球菌抗原阳性。
血液标本真菌抗体测定作为疾病动态监测指标有临床意义，但不能用于早期诊断。血液标本各种真菌PCR测定方法，包括二步法、巢式和实时PCR技术，虽然灵敏度高，但容易污染，其临床诊断价值有待进一步研究。
（陈方方 于翠香）