免疫监视是机体阻止肿瘤发生发展的重要机制，而在免疫逃逸阶段，肿瘤与肿瘤微环境通过多种途径抑制抗肿瘤免疫，导致肿瘤进展。表达于肿瘤及免疫细胞表面的免疫检查点分子是目前抗肿瘤免疫研究的热点，其中细胞毒T淋巴细胞抗原-4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4）、程序性死亡蛋白1（programmed cell death-1，PD-1）以及配体PD-L1（programmed cell death-Ligand 1，PD-L1）/L2研究最为广泛。深入研究食管癌免疫检查点分子表达与预后的关系，开展基于免疫治疗的临床试验，寻找预测免疫治疗疗效的新型生物学指标，将为食管癌免疫治疗疗效与预后评价、免疫治疗与传统治疗方式联合应用开拓新视野，提供新选择。

正常生理状态下，免疫检查点分子作为“免疫闸门”防止持续炎症与自身免疫病的发生。但在肿瘤免疫微环境中，免疫检查点信号通路的激活可抑制T细胞活化，从而抑制特异性抗肿瘤免疫反应。常见的免疫检查点分子，如PD-L1、PD-1、CTLA-4已成为肿瘤免疫治疗的关键靶点。近年来，针对免疫检查点分子的抗体已被FDA批准用于治疗进展期肺癌、膀胱癌、肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌和黑色素瘤。新免疫检查点分子，如T细胞免疫球蛋白和黏液蛋白-3（T-cell immunoglobulin and mucin containing protein-3，TIM3）和淋巴细胞活化基因-3（Lymphocyte activation gene-3，LAG3）也逐渐受到研究者重视。

CTLA-4表达于T细胞，其结构与T细胞共刺激分子CD28相似。初始T细胞的CTLA-4存在于细胞质内，当T细胞受到刺激开始活化时，CTLA-4迅速转移至细胞膜，并与CD28竞争性结合CD28配体B7-1（CD80）和B7-2（CD86），抑制T细胞活化所需第二信号，从而将T细胞活化阻断在初始阶段。在CD4 ⁺辅助性T细胞中，CTLA-4可下调效应T细胞，上调调节性T细胞，终止免疫反应。CTLA-4是免疫治疗的靶点之一，CTLA-4抗体通过阻断T细胞表面的CTLA-4分子与抗原提呈细胞表面的B7分子结合使T细胞激活，肿瘤抗原特异性T细胞增殖扩增，发挥细胞毒效应。Ipilimumab（伊匹单抗）和Tremelimumab（曲美母单抗）是抗CTLA-4的人源单克隆抗体，两者分别为IgG1和IgG2亚型，均已被FDA批准用于一线治疗转移性黑色素瘤。

PD-1/PD-L1/2途径是另一免疫治疗的重要靶点。PD-1表达于T细胞和NK细胞表面，PD-1有两个主要配体：PD-L1和PD-L2。PD-L1在T细胞、B细胞、树突细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、骨髓源性肥大细胞和一些非造血细胞上表达；PD-L2在树突状细胞、巨噬细胞、骨髓源性肥大细胞与静止腹膜B1细胞上表达。许多肿瘤细胞高表达PD-L1和PD-L2，其与PD-1结合后可抑制T细胞活化，导致T细胞耗竭，从而使肿瘤细胞逃避免疫监视。抗PD-1抗体阻断PD-1与PD-L1的相互作用，抑制了抑制性信号向T细胞内传递，维持具有杀伤功能的T细胞的持续活化。抗PD-1抗体Pembrolizumab（派姆单抗，KEYTRUDA）和Nivolumab（纳武单抗）是人源IgG4单克隆抗体，目前已被FDA批准用于多种恶性肿瘤的治疗，包括转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌等；抗PD-L1抗体Durvalumab为人源性IgG1单克隆抗体，已被FDA批准用于治疗晚期膀胱癌。

2005年，日本学者Ohigashi等首次报道用RT-PCR法检测41例食管鳞癌术后标本，PD-L1/2 mRNA表达率为44%，并与不良预后相关（1年总生存率50%/100%，中位随访25月， P=0.008）；免疫组化法检测31例样本，PD-L1阳性率42%，PD-L2阳性率48%，均与不良预后相关。由此说明，RT-PCR法和免疫组化检测PD-L1/2表达能得到一致结果。但之后研究多以免疫组化检测PD-L1的表达。2015年，韩国学者Lim等检测了73例新辅助放化疗（5-Fu/DDP，44Gy）和新辅助化疗后（5-Fu/DDP）的食管鳞癌术后标本，PD-L1阳性率56%，并与OS显著降低相关（17/33m， P=0.02），多因素分析PD-L1表达是预后不良因素（危险因素2.29， P=0.023）。该研究还分析了28例治疗前和术后食管鳞癌配对样本，其中19例接受新辅助放化疗者，PD-L1表达水平较疗前显著升高（ P=0.007），9例接受新辅助化疗者，PD-L1表达水平较疗前显著下降（ P=0.048）。2016年，日本学者Tanaka等共分析了180例单纯手术和新辅助放化疗后手术的食管鳞癌样本，全组表达PD-L1、PD-L2分别为53（29.4%）、88（48.3%）。全组分析显示PD-L1、PD-L2阳性者的OS均低于阴性者（ P=0.001， P=0.023 7）。PD-L1阳性者多接受过新辅助放化疗（ P=0.013 9），而PD-L2阳性与是否行新辅助放化疗无相关性（ P=0.612 7）。PD-L1表达水平与放化疗疗效未见相关性（ P=0.311 8），而PD-L2阳性者放化疗疗效不佳（ P=0.003 4）。联合放化疗可能更为有效地激活抗肿瘤免疫应答，新辅助放化疗后PD-L1表达升高可能是抗肿瘤免疫活化的负反馈反应。2016年，日本学者Ito等在90例单纯手术的食管鳞癌样本中检测PD-L1和人白细胞相关抗原I（human leukocyte antigen class I，HLA-I）的表达，PD-L1、HLA-I高表达分别为17例和35例，PD-L1的高表达与肿瘤侵袭程度（ P=0.037 9）、淋巴结转移（ P=0.003 1）、复发（ P=0.008 5）、低OS相关（5年OS%，28.4%/60.9%， P=0.011）。同时高表达HLA-1与PD-L1者预后极差（中位生存时间，13.1/102.5m， P=0.002 7）。联合PD-L1表达与多种免疫或肿瘤突变指标，可能为更为准确地预测预后提供新选择。

2011年，德国学者Loos等检测了101例食管远端barrett腺癌的手术标本，PD-L1阳性率73%，高表达率37%。PD-L1高表达与较晚的T分期（ P=0.002）、较晚的国际抗癌联盟（Union for International Cancer Control，UICC）分期（ P=0.022）、手术不完全切除（ P=0.009）相关。相对于PD-L1低表达或阴性者，PD-L1高表达者OS显著降低（38/136月，HR 3.5， p<0.001）。2015年，美国学者Derks等检测了354例手术食管腺癌标本，PD-L2阳性率51.7%，而PD-L1阳性率仅为1.7%，PD-L2阳性与较早的T分期、较小的瘤体积、较高的分化程度相关，PD-L1、PD-L2的表达水平与OS无关。研究者在检测食管癌前病变的标本中发现，PD-L2仅表达于barrett食管中，而未见于其他类型的反流性食管炎中，研究者认为食管鳞状上皮化生为barrett的过程，伴随Th2细胞因子IL-4、IL-13的升高，此过程可诱导PD-L2的表达。

关于食管癌的研究多为小样本，接受的手术和术前治疗多样，评价阳性的标准不一，针对食管腺癌的报道有限。总体而言，与其他实体瘤的研究结果相似，食管癌PD-L1/L2的表达是预后不良因素，食管癌CTLA-4表达目前未见更加可信和有效的报道。

2010年，英国学者Ralph C等报道了抗CTLA-4单克隆抗体Tremelimumab治疗转移性胃癌或食管腺癌的Ⅱ期临床试验结果，Tremelimumab每3个月给药一次直至疾病进展，该研究共入组18例患者，药物相关不良反应轻微。1例死于复合性肠炎肠穿孔，4例疾病稳定（Stable disease，SD），1例部分缓解（Partial response，PR），持续8周期（25.4个月）。18例中5例可检测到肿瘤相关抗原5T4的扩增，13例可检测癌胚抗原变化的样本中有5例扩增，治疗后癌胚抗原扩增者OS好于未扩增者（17.1/4.7月， P=0.004）。治疗前IL-2水平高者临床获益明显，同时伴随较大的药物相关不良反应。由此提示机体抗肿瘤免疫功能以及对免疫治疗的敏感性与疗效密切相关。

2017年，日本学者Toshihiro Kudo公布了抗PD-1抗体nivolumab治疗食管鳞癌的开放、单臂、多中心、二期临床试验结果。入组标准为疾病进展期或不能耐受氟尿嘧啶类、铂类、紫杉类为基础化疗的食管鳞癌或腺癌。Nivolumab静脉输注3mg/kg，每14天一次。65例入组患者均为食管鳞状细胞癌，其中1例因合并其他原发癌剔除出组。中位随访时间10.8个月，11例（17%）疗效评价为客观缓解。4级呼吸困难和4级低钠血症各1例，3级肺感染5例，3级食欲下降、3级血肌酐磷酸激酶增高、3级脱水各1例。严重不良事件包括肺感染4例、脱水2例、间质性肺病2例，低钠血症、呼吸困难、疲劳、肝功能异常、腹泻、胆管狭窄、胃肠炎、肺炎、水肿和背痛各1例，无治疗相关死亡。2018年，中国学者黄镜等报道了抗PD-1抗体SHR-1210治疗复发或转移食管癌的Ⅰ期临床试验结果。SHR-1210静脉输注首次剂量60mg，首次治疗4周后剂量升至200mg，以后每2周输注400mg直至疾病进展或产生不可耐受的毒性。30例患者入组，10例疗效评价为客观缓解，中位无进展生存期（Progress free survival，PFS）为3.6月。3例出现治疗相关毒性，肺炎2例，肌钙蛋白I升高1例，无4级不良反应。外显子测序分析发现肿瘤突变负荷和潜在突变相关的新抗原计数与对治疗的反应相关。15例PD-L1染色>5%中7例达到客观缓解，而9例PD-L1染色<5%中仅1例达到客观缓解。

此外，肿瘤疫苗、过继性细胞治疗（Adoptive T-cell therapy，ACT）的应用也见报道。2008年，日本学者Hisashi Wada等使用NY-ESO-1抗原作为肿瘤疫苗治疗8例食管癌患者，皮下注射NY-ESO-1重组蛋白每2周一次，在8例患者中7例产生诱导抗体，7例可观察到CD4 ⁺T细胞反应，6例可观察到CD8 ⁺T细胞反应。在6例可进行疗效评价的患者中，观察到1例PR、2例SD和2例混合临床反应，未见明显的不良反应。免疫组化分析4例患者接种前后肿瘤组织中NY-ESO-1和主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ类抗原表达和免疫细胞浸润情况，结果显示2例CD4 ⁺和CD8 ⁺T细胞浸润消失，1例CD68 ⁺巨噬细胞数量增加，1例肿瘤抗原消失。然而，疫苗接种后肿瘤最终仍能通过多种机制继续生长，检测肿瘤疫苗安全性及与放化疗结合等临床试验目前正在开展。

ACT将体外扩增的肿瘤抗原特异性或非特异性的免疫细胞回输至肿瘤宿主体内发挥抗肿瘤效应。目前已有若干ACT治疗食管癌的Ⅱ期临床试验，靶向的抗原包括黑色素瘤相关抗原MAGE-A3、MAGE-A4、NY-ESO-1。ACT存在的主要问题是难以从患者体内获得足量的T细胞进行回输，基因工程的发展有助于解决这一难题。2015年，日本学者Kageyama S等首次将T细胞受体（T-cell receptor，TCR）基因转导的T细胞移植至MAGE-A4阳性表达的进展期食管癌患者体内，10例患者分为三个回输剂量组。TCR-T细胞在外周血可持续至少1个月，其水平与回输细胞量成正比，5例患者持续了5个月以上。尽管移植的T细胞长时间持续，7例患者在治疗后2个月内显示肿瘤进展，3例基线水平肿瘤最小的患者存活超过27个月。嵌合抗原受体T细胞（Chimeric antigen receptor T-Cell，CAR-T）是基因工程T细胞的另一种类型，其将靶抗原特异性抗体的单链可变区和T细胞信号分子融合表达于T细胞表面，使T细胞发挥特异性杀伤肿瘤的功能。目前，CAR-T在血液系统肿瘤中显示较好疗效。

多个实体瘤免疫治疗的临床试验报道基线PD-L1高表达者对免疫治疗获益更明显，部分入组标准中剔除PD-L1阴性者。正在进行的临床试验如KEYNOTE-012是抗PD-1抗体pembrolizumab治疗进展期胃癌或食管胃结合部癌，该试验剔除了PD-L1阴性者，初步研究结果显示PD-L1高表达者ORR、OS、PFS均高于低表达者（ P=0.10、0.16、0.12）。CKECKMATE-032是nivolumab治疗进展期胃癌或食管胃结合部癌，该研究对PD-L1的表达状态分别设1%和5%两个cut-off值，客观缓解率（Objective response rate，ORR）在PD-L1阳性组均显著高于阴性组（1%cut-off，27%/12%）（5%cut-off，33%/15%）。PD-L1阳性者接受手术及放化疗效果差，但可在免疫治疗中获益，探索PD-L1/L2表达的调节机制、与肿瘤浸润T细胞或树突细胞的相关性，将为进一步阐明机制提供线索。

中国学者Huang等于2018年最新报道在SHR-1210治疗疾病进展或不能耐受化疗的晚期食管癌的Ⅰ期临床试验中，肿瘤突变负荷、预测的新抗原数量高或PD-L1阳性患者预后较好。同年，日本学者Doi等报道了来自KEYNOTE-028的食管癌研究结果，干扰素-γ相关信号通路分子表达评分高的患者接受pembrolizumab治疗后肿瘤进展延迟，治疗反应明显。

现有的新免疫疗法治疗食管癌的临床试验大多同时包括鳞癌与腺癌，然而食管鳞癌和腺癌是不同的疾病类型，二者具有不同的分子标志，今后靶向治疗的临床试验应加以区分。一项早期研究中，Agrawal等对23例食管癌（腺癌11例，鳞癌12例）进行全外显子测序，发现鳞癌存在21%的Notch1失活突变，而腺癌未发生失活突变。分析中国食管鳞癌患者Notch1基因序列，发现48例中仅1例突变（2%），提示预测预后的生物学标志物可能还受种族的影响。Wang等用新一代基因测序技术分析与癌基因相关的315个外显子与28个内含子，鳞癌与腺癌有相似点也有侧重点，例如除Notch1外，鳞癌更频繁携带PIK3CA和PTEN的突变，而腺癌具有较高的KRAS突变与HER2基因扩增率。Hu等通过全基因序列分析发现食管鳞癌突变的基因还有 Janus kinase 3（ JAK3）、 Breast Cancer Susceptibility Gene 2（ BRCA2）、成纤维细胞生长因子 2（ Fibroblast growth factor 2， FGF2）、 F- box/ WD repeat- containing protein 7（ FBXW7）、 MutShomolog 3（ MSH3）、 Patched（ PTCH）、 Neurofibromin 1（ NF1）、 Human epidermal growth factor receptor 2（ HER2）、 Checkpoint Kinase 2（ CHEK2）等，其中许多是治疗潜在的靶点。虽然这些发现未进入临床实践，但为今后临床试验设计奠定了坚实基础。

食管癌免疫检查点分子的表达，通过抗肿瘤免疫逃逸的机制参与了食管癌的发生发展，针对免疫检查点分子的研究，将为食管癌免疫治疗疗效评价与预后评估、多种治疗方式联合应用提供新思路。

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