金属螯合杂化硅胶整体柱的制备及在线SPE-HPLC测定牛奶中氟喹诺酮类药物残留

金秋，魏海英^*，吕运开

（河北大学化学与环境科学学院，保定 071002）

高效螯合色谱（HPCIC）是当今较为成熟的一种色谱技术，它是使用高效螯合离子交换色谱柱作为分离介质，检测和分析复杂样品中残留的金属离子^[1]。金属螯合色谱（MCAC）通常也叫做固定化金属螯合色谱（IMAC），是高效螯合色谱的一种，在检测和纯化蛋白质以及多肽类物质时有较好的效果，从而引起了人们的广泛关注^[2-4]。IMAC具有较好的配体稳定性、简单的再生条件、高容量、适宜的洗脱条件和低的消耗等特点，成功地应用在了分离生物大分子方面。IMAC能够较好的吸附蛋白质类物质，同时很多不同的金属如Ni²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺等都被用作固定化金属，与蛋白质形成螯合作用^[5-6]。

根据金属螯合色谱固定相与蛋白质发生亲和作用的原理，以及氟喹诺酮类药物结构特性，本工作采用溶胶-凝胶的方法合成了大孔杂化硅胶整体柱基质，并在基质表面接枝环氧基，其环氧基团与亚氨基二乙酸反应，再络合铜离子，获得金属螯合杂化硅胶整体柱，并将其应用于在线固相萃取-液相色谱测定牛奶中氟喹诺酮类药物残留。

1　实验部分

1.1　试剂和仪器

盐酸环丙沙星（CIP），恩诺沙星（ENR），洛美沙星（LOM），诺氟沙星（NOR），甲基三甲氧基硅烷（MTMS），四乙氧基硅烷（TEOS），3-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷（KH-560，EPTS），亚氨基二乙酸（IDA），碳酸钠，硫酸铜，甲醇，乙腈，冰醋酸。其他试剂均为分析纯或色谱纯，液相色谱所用试剂和溶液需在0.45μm滤膜过滤后使用，水为二次蒸馏水。

高效液相色谱仪（岛津LC-20A液相色谱），Venusil XBP C18色谱柱（5µm, 250mm × 4.6mm，博纳艾杰尔，中国）。色谱条件：流动相为乙腈-0.1%三氟乙酸溶液（25 : 75，体积比），流速为0.8ml/min；紫外检测波长为280nm，温度为25℃。

1.2　金属螯合-大孔杂化整体柱的制备

1.2.1　环氧基杂化整体柱的制备

将合成的杂化整体柱先用甲醇冲洗2h除去整体柱中的DMF，再用0.1mol/L HCl溶液冲洗活化2h，随后用高纯水冲洗至流出液为中性。最后使用甲醇冲洗30min，除去残留的水，氮气吹干，除去残留的溶剂。将EPTS与无水甲醇以3 : 2的体积比混合，用泵以0.05ml/min的流速连续通过整体柱，在40℃水浴中反应12h。随后将修饰好的杂化整体柱继续用大量的甲醇和DMF冲洗，以用来除去未反应的物质，冲洗结束后，将不锈钢柱在40℃下真空干燥过夜。

1.2.2　金属螯合杂化整体柱的制备

准确称取12.72g碳酸钠并溶解在120ml的水中，将6.0g的亚氨基二乙酸加入到碳酸钠溶液中，并调节溶液的pH值至8.0。将整体柱竖直放置在60℃的柱温箱中，用液相泵输送上述溶液，以恒定流速（0.05ml/min）流过整体柱，动态接枝反应6h。为了获得较好的接枝效果，调换柱子进液端，重复以上步骤。反应结束后，将整体柱依次用水、10%的乙酸溶液和水冲洗至流出液至中性。

在铜离子的固定过程中，准确称取1.248g硫酸铜，溶解在60ml的水中，并以恒定0.05ml/min的流速通过整体柱，室温下反应3h。然后从整体柱另一端进液，重复以上步骤。反应完后，用0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液将未固定的铜离子洗去，将制备的金属螯合杂化整体柱保存在甲醇溶液中。

1.2.3　实际样品分析

准确称取5.2138g牛奶样品（超市购买），加入10ml乙腈溶剂，混匀5min后，超声萃取10min，取上层清液分别加入到10ml的离心管中，10000r/min的条件下离心10min，收集上清液，重复提取残渣一次，合并两次提取液，用0.22µm微孔过滤膜过滤。分别加标浓度为0.05mg/kg、0.10mg/kg、0.2mg/kg和0.5mg/kg的标准溶液，平行三次实验。

2　结果与讨论

2.1　合成机理研究

首先采用溶胶-凝胶方法制备大孔杂化整体柱，它的大孔连续网状结构能够提供较多的键合空间和键合位点。原位结合环氧基团后，同亚氨基二乙酸反应，就在整体柱孔道中形成螯合配体。这种三齿配体有足够的配位原子能够与铜离子形成较强的键合作用。同时，铜离子所形成的空键合轨道能够提供较多的键合位点，从而能有效地吸附蛋白质分子和药物小分子。

2.2　材料的表征

通过图1中曲线（a）和（b）的对比，3437.00cm⁻¹处的-OH吸收峰明显增加，同时935.37cm⁻¹处的环氧，1128.50cm⁻¹处的Si-O-Si和1029.34cm⁻¹的C-O吸收峰明显变小，证明了IDA接枝成功。通过图1中曲线（b）和（c）的对比，由于铜离子的吸收峰在指纹区没有较强的吸收峰变化，只有在3437.00cm⁻¹处的-OH吸收峰有明显的降低间接证明了Cu²⁺成功地固定在了IDA键合的杂化整体柱上。

如图2所示，在100～250℃之间，由于水和有机溶剂的蒸发，（a）和（b）都有较小的失重。在300～400℃之间，亚氨基二乙酸键合的杂化整体柱有两个阶段的失重过程，而环氧-杂化整体柱在400℃只存在一个阶段的失重过程。通过热重分析，证明了IDA接枝成功。

从图3（a）和（b）来看，所制备的整体柱都具有较均一、连续的网络骨架结构。杂化整体柱和金属螯合杂化整体柱所具有的大于10μm的通孔为在线联用分析提供了较低的柱压以及在化学修饰过程中提供了足够大的孔空间，均匀的网络骨架结构减少了整体材料管壁剥离问题。

2.3　标准曲线

通过高效液相色谱，测定了浓度（mg/L）为0.05、0.1、0.2、0.5和1.0的ENR、NOR、CIP和LOM的混合溶液。如表1所示，为氟喹诺酮类药物的标准曲线，各目标物均表现出了良好的线性，线性相关系数均大于0.95。通过三倍噪声法，计算仪器检出限均低于16.24 μg/kg。

2.4　在线预富集

采用0.05mg/L的氟喹诺酮类药物为上样溶液，考察了金属螯合杂化整体柱（MC-HMC）的在线富集能力。通过在线萃取和标准溶液直接进样的标准曲线斜率之比，来计算富集因子。如表1所示，ENR、NOR、CIP和LOM的富集因子分别是15.4、18.6、14.9和18.5。详细考察了不同进样体积的富集效果，其色谱图（图4）表明了MC-HMC对磺胺类药物有较好的富集效果。

2.5　在线净化

为了考察MC-HMC对生物样品的净化能力，分别采用空白牛奶样品，加标牛奶样品、商品HLB固相萃取柱净化的加标牛奶样品和MC-HMC净化的加标牛奶样品进行比较研究。如图5所示，（d）的噪声明显低于（a）和（b），表明经过预处理的样品，不会干扰测定。通过比较图5（a）和图5（b），证明了方法有较好的重复性。当与商用的HLB柱比较时，MC-HMC显示出了较好的净化和富集能力，同时不会造成基线的漂移。

2.6　在线固相萃取-液相色谱联用技术检测牛奶中氟喹诺酮类药物

如表2是在线方法的特征参数。ENR、NOR、CIP和LOM的平均回收率在88.60%～102.00%，73.40%～96.00%，76.00%～100.15%和93.60%～102.40%之间。ENR的方法检出限和定量限为11.16µg/kg和36.83µg/kg，NOR的方法检出限和定量限为12.50µg/kg和37.50µg/kg，LOM的方法检出限和定量限为15.43µg/kg和46.29µg/kg，CIP的方法检出限和定量限为13.57µg/kg和40.71µg/kg。相对标准偏差在2.05%～5.75%之间。

3　结论

本文以接枝环氧基硅烷的杂化整体柱作为基质，键合亚氨基二乙酸并络合铜，制备了一种新型的金属螯合-大孔杂化硅胶整体柱。将整体柱作为预柱，与高效液相色谱联用，对牛奶样品中氟喹诺酮类药物进行在线富集检测，并与商用HLB柱进行了对比。该方法显示出较好的净化和富集效果。

参考文献

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[2] Mooney JT, Fredericks DP, HearnMT. Sep Purif Technol, 2013, 120: 265-274.

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[4] Mehyou Z, Lobinski R, Hagège A. Talanta, 2011, 87: 168-173.

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基金项目：国家自然科学基金资助项目(21375032)、河北省自然科学基金项目(B2016201213)

^*通信作者：魏海英, 女, 副教授, Tel :13315289983, E-mail：snake3cn@163.com