姜黄及其食品中姜黄素类化合物含量的测定
孙鹏尧，牟德华*
（河北科技大学生物科学与工程学院，石家庄 050018）
姜黄，为姜科姜黄属植物的干燥根茎，是多年生草本植物，主要分布在中国、印度、缅甸及其他热带、亚热带地区，在国内已确证的姜黄属植物多达12种。姜黄素类化合物为它的主要生物活性成分，具有抗炎[1-2]、抗氧化[3]、抗肿瘤[4]、抗癌、抗病毒[5]、抗动脉粥样硬化[6]、清除自由基[2]、降血脂[6]、保肝护肝[7]等多种药理功效。姜黄素类化合物多用于医药、食品着色剂以及化妆品上[8]，它作为药物中的有效成分和重要的天然色素染料几乎没有任何副作用[9]，因此应用日益广泛，并逐渐被应用到保健食品上。但是目前对于食品中的姜黄素的测定缺乏相应的检测方法。因此，建立简便可行的HPLC检测方法极为重要。
姜黄素类化合物的检测方法主要有分光光度计法、薄层色谱法、毛细管电泳法、HPLC法等[10-13]。其中，分光光度计法适用于姜黄素的初级定量，测定的是总姜黄素类化合物的含量[14]；薄层色谱法通常用来做半定量或限定实验，由于姜黄素类化合物不稳定，在薄层上分离时容易受光及其他因素影响，导致目标检测物测定结果不够精确[14]；毛细管电泳法相对于其他分析方法来说重现性较差；HPLC法因其分离效果好、选择性好、灵敏度高等特点是目前测定姜黄素类化合物常用的方法[15-18]。本文建立了一种测定姜黄根茎和食品中的姜黄素类化合物的方法，该方法简便、快捷、重现性好，可用于姜黄及其同属植物以及食品中姜黄素类化合物的含量。
1 实验材料
1.1 试剂与仪器
姜黄素对照品（Ⅰ）、去甲氧基姜黄素对照品（Ⅱ）、双去甲氧基姜黄素对照品（Ⅲ）（纯度均≥98%），成都艾科达化学试剂有限公司；干燥姜黄根茎（河北食品添加剂有限公司提供和购自当地药店）；市售姜黄饮料（购买自日本市场）；乙醇（分析纯）；乙腈、甲醇（色谱纯）；实验用水为高纯水，其他试剂均为分析纯。
SHIMADZU高效液相色谱仪(HPLC)LC-20A，日本岛津公司；DIKMA Platisil ODS柱（4.6mm×250mm,5μm）色谱柱，迪马科技；Spectrum紫外分光光度计756P，上海光谱仪器有限公司；DELTA 320型pH计、ARI 140型电子分析天平，JJ 1000型电子天平，KQ5200DE型数控超声波清洗器，FW135型中草药粉碎机Re-201旋转蒸发器等。
1.2 色谱条件
色谱柱DIKMA Platisil ODS [4.6mm×250mm,5μm]，流动相乙腈-水（磷酸调pH值为3.0）为流动相，采用梯度洗脱0→10min，乙腈浓度为60%；10→15min，乙腈浓度由60%升到65%，15→20min，乙腈浓度由65%降到60%；流速1ml/min；柱温30℃，检测波长 425nm；进样量为20μl。
1.3 对照品溶液的配制
准确称取姜黄素对照品Ⅰ 0.0250g、Ⅱ 0.0240g、Ⅲ 0.0240g分别置于25ml的容量瓶中，用甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为1mg/ml的对照品储备液。分别吸取上述对照品溶液各5ml，加甲醇定容至25ml，作为姜黄素类化合物对照品溶液。
1.4 样品处理
姜黄根茎：将干燥的姜黄根茎用粉碎机粉碎，过40目筛得姜黄粉末，放真空干燥器中备用。称取1.0000g姜黄粉末于150ml锥形瓶中，加入20ml 90%乙醇超声提取（功率为100W，40℃）30min，4500r/min离心15min，提取3次，合并上清液于100ml容量瓶中，用乙醇定容至刻度。
姜黄素饮料：取5.00ml样品于50ml离心管中，加入25ml 90%乙醇超声波提取（功率为100W，室温）15min，4500r/min离心15min，取上清液于50ml容量瓶中，用乙醇定容至刻度。
进样前过0.45μm的滤膜。
2 结果与讨论
2.1 线性关系考察
精密吸取姜黄素类化合物对照品溶液将其稀释2倍、5倍、10倍、100倍和200倍，在最优的色谱条件下检测。以不同浓度的姜黄素类化合物为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并得出线性回归方程。姜黄素类化合物的线性回归方程、相关性系数R2与检出限（LOD）见表1。
表1 双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的回归方程及检出限[18]
2.2 精密度实验
精密吸取姜黄素类化合物对照品溶液，测定其峰面积积分值，重复6次，记录色谱峰面积（见图1），结果双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为0.54%、0.41%、0.51%。结果表明本方法精密度良好。
图1 姜黄素类化合物的对照品溶液色谱图
1—双去甲氧基姜黄素；2—去甲氧基姜黄素；3—姜黄素
2.3 稳定性实验
精密吸取姜黄素类化合物对照品溶液20μl，分别在0、2h、4h、6h、8h、10h测定其峰面积，结果RSD（n=5）分别为0.77%、0.69%、0.81%，表明10h内稳定。
2.4 重复性实验
取同批姜黄粉末各5份，分别按照1.4样品处理的方法处理后，进样测定，并对所的数据进行处理，结果姜黄素类化合物的平均含量分别为4.493μg/ml、36.13μg/ml、289.7μg/ml，RSD分别为0.89%、0.92%、0.74%，表明该方法的重复性良好，能够可靠、稳定的测定姜黄素饮料中姜黄素类化合物的含量。姜黄根茎样品色谱图见图2（a），饮料样品色谱图见图2（b）。
图2 姜黄根茎提取液（a）和饮料中姜黄素类化合物（b）色谱图
2.5 加标回收率实验[19]
精密取已知含量的同批姜黄粉末9份，分组加入样品中各成分含有量的80%，100%，120%的对照品，按照1.4样品处理的方法制备所需溶液并进行分析，结果双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素的平均回收率分别为106.87%、105.28%、96.86%；RSD（n=9）分别为1.24%、0.48%、0.26%。实验结果表明该方法回收率较高，准确度较好。
2.6 不同种类的姜黄和饮料中姜黄素类化合物的测定
分别取不同种类的姜黄提取液或饮料样品处理供试液，精确吸取20μl注入液相色谱仪，测定其中姜黄素类化合物的含量，不同种类的姜黄根茎测定结果见表2；不同种类的姜黄素饮料测定结果见表3。
表2 姜黄根茎样品测定结果（n =3）
表3 姜黄素饮料样品测定结果（n = 3）
由表2数据结果分析，不同地区生长的姜黄中所含姜黄素类化合物的含量不同。在所分析的姜黄根茎中姜黄素类化合物含量最高的印度二批的姜黄，其次是缅甸三批的姜黄、印度一批的姜黄，含量最低的是四川一批姜黄。姜黄素的含量大小排列具有同样的顺序。然而姜黄素在姜黄素类化合物中所占的比例最大的是印度二批姜黄，为63.07%，其次是四川一批姜黄，所占比例为62.27%，再次是印度二批和缅甸一批，所占比例分别是59.25%和56.98%。去甲氧基姜黄素含量最高的是印度二批姜黄，其次是缅甸三批和缅甸二批。双去甲氧基姜黄素含量最高的是缅甸三批，其次是缅甸二批和印度二批。另外，印度二批的姜黄中所含的姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素的含量所占比例大致相同。
由表3数据分析可知，所研究的5种姜黄素饮料中主要的姜黄素类化合物成分均是姜黄素，分别约占姜黄素类化合物总量的87.5%、85.6、87.8%、88.0%和94.1%。其中，饮料2中的双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素含量最高，饮料5中的姜黄素含量最高。
虽然这3种姜黄素类化合物在结构上相近，很多生理活性相似，但是由于它们在结构上烷氧基的微小差异，使其在生理功效上也有所不同[20-22]。例如在抑制血管平滑肌细胞的增殖、动脉粥样硬化的形成方面最强的是姜黄素，其次是去甲氧基姜黄素[23]；在抑制人内皮细胞生长增殖作用活性最强的是双去甲氧基姜黄素[24]。在抑制脂质过氧化方面，活性强弱顺序依次是姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素[25]。因此，不同种类的姜黄素饮料其中的各姜黄素类化合物的含量有所不同，其保健的侧重点也不相同。
3 结论
本研究对不同品种的姜黄和食品中的姜黄素类化合物进行了测定，建立了准确可靠的HPLC方法。该方法操作简单，并且具有较高的准确性和精密性，能够同时测定姜黄根茎及饮料中3种姜黄素类化合物的含量，为保健品中姜黄素类化合物的测定提供了参考依据。
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*通信作者：牟德华，男，教授，研究方向：农产品加工。E-mail: dh_mou@163.com