3.3 免疫检测原理
3.3.1 抗原-抗体反应
3.3.1.1 抗原-抗体反应的原理
抗原-抗体反应（antigen-antibody reaction），即抗原与抗体之间的特异性反应，可发生在体内，也可发生在体外。在进行体外免疫学实验时，通常是以存在于血清中的抗体为材料进行的，所以体外免疫学反应也称为血清学反应（serologic reaction）。抗原与抗体的特异性结合是以抗原决定簇和抗体分子抗原结合部位之间的直接接触为基础的，其过程以非共价键提供主要的结合能量，包括非极性氨基酸侧链之间的疏水键、带有不同电荷的氨基酸残基侧链之间的离子键、相反极性电子云团之间的范德华力和不同原子间的氢键等，其中，最主要的是疏水键。
抗体（Ab）与大多数抗原（Ag）都是蛋白质。它们溶于水中形成蛋白质溶液，其分子表面有许多亲水基团，所以抗体、抗原的水溶液是亲水性胶体溶液，一般比较稳定，不会自然沉淀。当抗原与特异性抗体发生结合时，由于电荷减少或消失，而使它们由亲水胶体变成疏水胶体，甚至形成肉眼可见的抗原-抗体复合物。抗原-抗体的结合反应可以分为两个阶段：第一个阶段是抗原与抗体的特异性结合阶段，形成肉眼看不见的沉淀和凝集，这个过程很快，一般可在几秒钟内完成；第二个阶段为抗原与抗体间的可见反应，当抗原与抗体特异性结合后，在适当的电解质、温度和pH值等作用下，可促使抗原-抗体复合物由亲水胶体转化为疏水胶体，进而凝聚成更大的、可见的抗原-抗体复合物。
抗原-抗体的反应过程：
3.3.1.2 抗原-抗体反应的特点
（1）特异性 抗原-抗体反应的最大特点是特异性。如上文所述，抗体的特异性是由抗原的特异性决定簇产生的，抗原-抗体反应实际上是抗原决定簇和抗体的超变区之间的结合，由于它们两者之间的化学结构和空间构型上高度互补，所以决定了它们之间反应的特异性。但如果两种不同的抗原分子上有共同的或相似的抗原决定簇，就可能与彼此相应的抗体发生结合，即交叉反应。交叉反应对抗原-抗体反应试验的结果分析有干扰作用。因此，抗原-抗体反应使用的已知抗原或已知抗体需要鉴定和提纯，以确保试验的准确性。
（2）可逆性 抗原与抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离的抗原与抗体的特性称为抗原-抗体结合的可逆性。抗原-抗体的结合实际上是一个动态平衡的过程，其反应式为：
其反应平衡常数：
式中，［Ab］是抗体结合部位的浓度；［Ag］是抗原决定簇的浓度；［Ag·Ab］是二者结合物的浓度。K值可反映抗原-抗体之间的亲和力。亲和力高的抗体与抗原在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不容易解离；反之，亲和力低的抗原-抗体复合物较易解离。另外，许多环境因素如电解质的种类与浓度、pH值和温度等，都会影响抗原-抗体的结合。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性，因此可用亲和色谱法来提纯抗原或抗体。
（3）比例性 比例性是指抗原-抗体特异性结合时，生成肉眼可见结合物的量与反应物（抗原与抗体）浓度的关系。只有当抗原-抗体的浓度比例适当时，抗原-抗体才能出现最强的反应，通常表现为沉淀最多或吸光度最大等现象。抗原或抗体任何一方的浓度过高或过低都会影响它们的反应。在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物（沉淀）的量见图3-1。曲线的高峰部分是抗原-抗体浓度比例最合适的范围，称为等价带（zone of equivalence）。在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带。如果抗原或抗体极度过剩，则无沉淀物形成，在免疫测定中称为带现象（zone phenomenon）。抗体过量称为前带（prezone），抗原过量称为后带（postzone）。
图3-1 抗原-抗体反应中沉淀量与抗原、抗体的比例关系
抗原-抗体的比例性可用格子学说（lattice theory）进行解释。由于大多数天然抗原是多价的（即有多个抗原决定簇），而大多数抗体如IgG是二价的（即含有两个超变区，能结合两个相同的抗原决定簇），当抗原和相应的抗体数量比例适当时，抗体分子如IgG的两个超变区可分别结合两个相同的抗原分子，并相互交叉连接成网格状复合物，从而形成肉眼可见的沉淀。而当抗原或抗体过剩时，由于结合点不能相互饱和，所以只能形成小的沉淀或可溶性的抗原-抗体复合物。
3.3.2 免疫检测方法
3.3.2.1 免疫检测方法的分类
免疫检测方法种类很多，分类方法也有很多种。根据抗原（抗体）是否有被标记可分为标记免疫学技术、免疫沉淀反应和免疫凝集反应。标记免疫学技术（labeled immunological technique）是指抗原（抗体）被酶、同位素或荧光素等标记（连接）后与相应的抗体（抗原）反应，通过测定酶催化反应生成的产物量、同位素的放射性强度或荧光素产生的荧光强度来计算抗原-抗体的结合量，进而计算出待检测物质（抗原或抗体）量的方法。根据标记物的不同，标记免疫学技术又可分为酶标记免疫分析技术、放射标记免疫分析技术和荧光标记免疫分析技术等三种。免疫沉淀反应（immunological precipitation reaction）是将可溶性抗原与相应抗体在适量的电解质存在条件下发生特异性结合，形成抗原-抗体复合物并出现肉眼可见的沉淀或混浊，在固体载体中这种沉淀表现为沉淀线，在液体中则常表现为絮状物或使液体混浊。免疫凝集反应（immunological agglutination reaction）是将颗粒抗原（如细菌、血红细胞）或可溶性抗原（抗体）结合于不溶性的载体微粒上后与相应的抗体（抗原）反应，在适当条件下经一定时间后凝集成肉眼可见的凝聚物。标记免疫学技术主要用于定量免疫检测，而凝集反应和沉淀反应则多为定性分析方法。
根据免疫分析过程的反应状态还可把免疫学技术分为均相免疫学方法（homogeneous immunoassay）和非均相免疫学方法（heterogeneous immunoassay）。均相免疫学方法无需将反应后抗原-抗体复合物与游离的抗原、抗体分开，一般在较短时间内可以得到分析结果，操作比较简便，但是通常灵敏度较低，一般仅适合于定性分析；非均相免疫学方法抗原-抗体复合物与游离的抗原、抗体以及杂质等物质分开，程序比较复杂，操作时间长，但是由于去除了游离抗原、抗体分子以及一些杂质的干扰，因此灵敏度和特异性都比较高，适合于定量分析。
3.3.2.2 常用免疫检测技术简介
根据分类标准的不同可以将免疫检测方法分为很多种，如前面所说的标记免疫学技术、凝集反应和沉淀反应等等，这些技术还可以进一步进行分类。本节就这些技术中常用于食品安全检测中的几种进行介绍。
（1）酶联免疫吸附检测
①基本原理 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic technique）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。其基本原理是抗体（抗原）与酶结合后，仍然能和相应的抗原（抗体）发生特异性结合反应，将待测样品事先吸附在固相载体表面称为包被；加入酶标抗体（抗原），酶标抗体（抗原）与吸附在固相载体上的相应的抗原（抗体）发生特异性结合反应，形成酶标记的免疫复合物，不能被缓冲液洗掉；当加入酶的底物时，底物与酶发生酶促反应而显色，根据显色的程度而对标本中抗原（抗体）进行定性或定量的分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
②ELISA的种类 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂”（immunosorbent）；酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”（conjugate）；酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。ELISA常用的方法主要有以下几种类型：
a.夹心法 有双抗体夹心法（图3-2）和双抗原夹心法两种。两者步骤基本相同，但酶标记物和检测对象不同。双抗体夹心法测抗原的操作步骤如下：
图3-2 双抗体夹心法测定抗原示意图
ⅰ.将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。
ⅱ.加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原-抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。
ⅲ.加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
ⅳ.加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色测定得标本中抗原的量。
双抗原夹心法测抗体的反应模式与双抗体夹心法类似，不同之处是用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。
b.间接法 是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法（图3-3）。其操作步骤如下：
图3-3 间接法测定抗体示意图
ⅰ.将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
ⅱ.加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原-抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成分在洗涤过程中被洗去。
ⅲ.加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量成正相关。
ⅳ.加底物显色。
c.竞争法 此法可用于抗原与半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，其操作步骤如下：
ⅰ.将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
ⅱ.加入固定量的待测抗原和特异性酶标抗体，保温反应，使固相抗原与待测抗原二者竞争性结合酶标抗体，经洗涤除去游离的抗原、抗体及抗原-抗体复合物等。结合于固相抗原上的抗体与待测抗原含量成负相关，即：待测抗原浓度越高，与待测抗原结合的抗体越多，与固相抗原结合的抗体越少；待测抗原浓度越低，与待测抗原结合的抗体越少，与固相抗原结合的抗体越多。
ⅲ.加底物显色。
d.捕获法 在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用，呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断，如甲型肝炎病毒（HAV）抗体的检测。
③ELISA的技术要点
a.固相载体 用于吸附抗体与抗原，是ELISA中必不可少的工具。常用的有聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯和聚丙烯酰胺等，目前最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯板的要求：
ⅰ.具有较强的吸附蛋白质的性能，且不影响蛋白质的免疫活性；
ⅱ.空白值低，孔底透明度高；
ⅲ.不同板和同一板各孔间性能基本一致。
b.包被 将抗原（抗体）固相化的过程称为包被（coating）。常用的聚苯乙烯酶标反应板的包被方法：将抗原（抗体）溶于50mmol/L pH9.6碳酸盐缓冲液，加于酶标反应板孔中，4℃包被过夜或37℃包被2～6h，经清洗后可用。包被的最适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。
c.封闭 继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程是封闭（blocking）。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的步骤与包被相类似。最常用的封闭剂是0.05％～0.5％牛血清白蛋白，也有用10％小牛血清或1％明胶作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的特点是价廉，可以高浓度使用（5％）。
d.最佳工作浓度的选定 ELISA反应试剂多，其工作浓度不同对结果影响较大。因此，必须对包被抗原（抗体）和酶标抗体（抗原）进行最佳工作浓度的滴定和选择，以达到最佳的测定条件。
（2）胶体金免疫色谱 胶体金免疫技术是指以胶体金为标记物，应用于抗原-抗体反应的一种新型标记免疫检测技术。这里的胶体金（colloidal gold）即金的水溶液，它有一般胶体溶液的特性。胶体金溶液的制备是利用凝聚法，主要是通过还原法，即在氯金酸溶液中加入还原剂如过氧化氢、磷、甲醛、苯肼等，使之聚合成为特定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。因为胶体金离子的表面具有吸附蛋白质的能力，故可以通过非共价键的形式吸附蛋白质抗原或抗体，实现对抗原或抗体的标记。金胶体还具有高电子高密度的特性，可在显微镜下观察到黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而常被用于定性或半定量的快速免疫检测中。
胶体金免疫色谱技术（colloidal gold immunochromatography assay，GICA）则是一种将胶体金标记技术、免疫检测技术和色谱分离技术等多种方法有机结合起来的固相标记免疫检测技术。其基本原理是以条状纤维色谱材料作为固相，将与待测物（抗原或抗体）相对应的抗体（抗原）固定于膜的其中一个区域（检测带），将胶体金标记物吸附于纤维的金标垫上，其一边与样品垫相连，一边与检测带相连（图3-4）。检测时，将待测样品加于样品垫上后，样品由于毛细管扩散作用向前移动，首先经过金标垫并水化干燥的胶体金标记物。样品中的待测物与被胶体金标记的抗体（抗原）发生特异性结合后，继续向前移动到达检测带，此时被间接标记的待测物再次与检测带上的抗体（抗原）发生特异性结合，从而使免疫复合物被富集或截留在检测带上，通过可目测的胶体金而得到直观的试验现象（显色）。
图3-4 双抗体夹心法检测AIV示意图（张继乐，2011）
胶体金免疫色谱技术的反应模式一般有三种，包括夹心法、间接法和竞争抑制法。监测未知抗原常采用双抗体夹心法和竞争抑制法，监测未知抗体采用双抗原夹心法和间接法。下面以双抗体夹心法测抗原为例说明其反应原理。此方法是在纤维膜上包被待测物相应的抗体，同时用胶体金标记相应抗体。如果样品为阳性，则样品中的抗原先和被胶体金标记的抗体免疫结合，到达检测线位置时，复合物又和固定在纤维膜上的抗体免疫结合，检测线形成可见的红色线。多余的金标记抗体继续进行色谱分离到检测线后的控制线，与相应的兔抗鼠二抗结合，控制线形成可见的红色线。如果样品为阴性，只有控制线形成可见的红色线。当检测线与控制线均不出现红色时，说明试纸条失败。
目前，胶体金免疫色谱技术主要应用于妊娠检测、病原体抗原或抗体检测、疾病相关蛋白检测以及动物疫病诊断中。该技术拥有简便、快速、特异、灵敏等优点，具有巨大的发展潜力和广阔的应用前景。
（3）荧光偏振免疫检测 荧光免疫技术是以荧光物质标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂，用于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定，是将抗原-抗体反应的特异性与荧光物质测定的敏感性和直观性结合起来的一种免疫分析技术。
荧光偏振免疫测定（fluorescence polarization immunoassay，FPIA）是荧光免疫技术的其中一类。它是一种均相竞争荧光免疫分析法。其基本原理如下：荧光素经偏振光照射后会跃入激发态，在回复至基态后可释放光子，经偏振仪形成偏振荧光。荧光偏振强度与荧光分子的大小成正比，与荧光物质受激发时分子转动速度成反比（图3-5）。如荧光标记的抗原由于分子量小，在溶液中的转动速度快，荧光偏振强度小；当荧光标记抗原与特异性抗体结合后，其免疫复合物分子量大，在溶液中转动速度变慢，荧光偏振强度就变大。FPIA就是利用检测荧光标记抗原在结合特异性抗体前后荧光偏振强度的变化，用竞争性方法间接测定溶液中小分子的含量。
图3-5 荧光偏振原理示意图（朱广华等，2004）
例如运用FPIA法检测药物浓度时，首先用异硫氰酸荧光素对小分子药物进行标记，然后将荧光素标记的小分子药物、可能含有待测药物的样品溶液以及该小分子药物的特异性抗体混合。若样品溶液中待测未标记的小分子药物浓度低，则标记的药物分子与抗体结合的就多，由于抗体分子体积大，所形成的荧光素标记的药物分子与抗体的结合物体积亦大，旋转慢，荧光偏振值高；若样品溶液中小分子药物浓度高，其将会与标记的药物分子竞争与抗体结合，以游离形式存在的标记药物增多，则荧光偏振强度就小。利用这一原理，用标记药物的浓度与对应的荧光偏振值做工作曲线，便可进行定量分析。另外，FPIA方法不仅能检测抗原，也能对抗体进行检测。
FPIA是均相的竞争免疫分析方法，反应系统完全在溶液中，不需要分离结合的和未结合的抗体。实验过程非常简单，仅仅是将抗体、荧光标记抗原和抗原（即被测药物）加入到反应杯中，经过几分钟甚至是几秒钟的温育便可直接测量，可很快得到被测药物的浓度。这是FPIA区别于其他免疫分析方法的最大优势。
（4）放射免疫检测 放射免疫分析（radio immunoassay，RIA）是以放射性核素为标记物的标记免疫分析法。由于标记物放射性核素的检测灵敏度高，本法的灵敏度可高达ng甚至pg水平，因此常用于测定受检样品中的微量物质，是灵敏度最高的微量检测技术。
放射性核素是指原子核能自发地产生成分或能级的改变，然后变成另一种核素，变化时伴有射线的发射。放射性核素依衰变方式分为α、β、γ三种，用于放射性标记的有β、γ两类；目前常用的是γ型放射性核素，如125I、131I等，以125I最常用。标记125I的方法可分为两大类，即直接标记法和间接标记法。直接标记法是将125I直接结合在蛋白质侧链的酪氨酸残基苯环上，形成单碘酪氨酸或双碘酪氨酸，操作简便，结合效率高，但只能标记含酪氨酸的化合物；间接标记法则是将放射性碘连接到一个小分子载体上，再将这个小分子载体与蛋白质结合。
放射免疫测定法可分为两大类，即液相放射免疫测定和固相放射免疫测定。
液相放射性免疫测定属于非均相竞争性标记免疫检测，其基本原理是用放射性核素标记抗原（Ag*），使其与待测标本中的抗原（Ag）竞争结合有限量的特异性抗体（Ab），并形成可溶性的抗原-抗体复合物Ag-Ab和Ag*-Ab，直到达到平衡。由于标记抗原与特异性抗体的量是固定的，故 Ag*-Ab形成的量就随着待测抗原的量而改变。待测抗原量增加，相应结合的抗体多，从而抑制标记抗原对抗体的结合，使Ag*-Ab相应减少，游离的标记抗原相应增加，即抗原-抗体复合物中的放射性强度与受检标本中抗原的浓度呈反比。反应平衡后，向反应体系中加入沉淀剂聚乙二醇，使Ag*-Ab复合物完全沉淀，以完成与游离标记抗原的分离。分离后分别测出结合态标记抗原（B）与游离态标记抗原（F）的放射性强度（脉冲数），即可计算出B/F值。用一系列不同剂量的标准抗原进行反应，计算相应的B/F值，可以绘制出一条剂量-反应曲线。受检标本在同样条件下进行测定，计算B/F值，即可在剂量-反应曲线上查出标本中抗原的含量。
固相放射免疫测定是将抗体吸附在固相载体上的免疫检测方法，分竞争性和非竞争性。竞争性分为单层竞争法、多层竞争法，非竞争性又分为单层非竞争法和多层非竞争法。
①单层竞争法 预先将抗体连接在载体上，加入标记抗原（Ag*）和待测抗原（Ag）时，二者竞争与固相载体上的抗体结合。若固相抗体和Ag*的量不变，则加入的Ag量越多，B/F值越小。根据这种函数关系，则可作出标准曲线。
②双层竞争法 先将抗原与载体结合，然后加入抗体与抗原结合，载体上的放射量与待测浓度成反比。此法较繁杂，有时重复性差。
③单层非竞争法 先将待测物与固相载体结合，然后加入过量相对应的标记物，经反应后，洗去游离标记物测放射量，即可算出待测物浓度。本法可用于测抗原、抗体，方法简单，但干扰因素较多。
④双层非竞争法 预先制备固相抗体，加入待测抗原使之结合成固相抗体-抗原复合物，然后加入过量的标记抗体，与上述复合物形成抗体-抗原-标记抗体复合物，洗去游离抗体，测放射量，便可测算出待测物的浓度（图3-6）。此法与ELISA的双抗体夹心法相似。
图3-6 双层非竞争法放射性免疫检测示意图（陶义训，2002）
放射免疫检测技术对所测样品的前处理要求简单，多数样品可直接用于测试。目前，研制成功了许多检测试剂。运用这一技术开展了对食品农药残留的生物技术检测研究，对水产品、肉类产品、果蔬产品中的农药残留量进行监测。