3.2 抗体的制备方法
3.2.1 多克隆抗体的制备
多克隆抗体（polyclonal antibody）是抗原或抗原与佐剂的混合物按一定程序直接免疫试验动物后获得的抗血清（antiserum）。由于抗血清中的抗体是由不同的抗原决定簇刺激不同的B淋巴细胞克隆产生的抗体混合物，所以称为多克隆抗体。多克隆抗体由于具有制备过程简单、操作容易、生产成本低、无需特殊的仪器设备等优势，目前在很多实验室仍为制备抗体的首选方法。
多克隆抗体的制备包括了实验动物的选择、抗原的处理、动物免疫以及抗血清的采集、纯化和鉴定等步骤。
（1）实验动物的选择 在多克隆抗体生产中应用最多的动物一般为鼠、兔和羊。在选择实验动物时，首先应考虑抗原的来源和免疫动物的亲缘关系。如上一节所述，两者的亲缘关系越远，其引起的免疫应答越强烈，产生的抗体效价越高，反之抗体的效价越低。实验动物的年龄、营养状态等生理特性对抗体的产生也有密切的关系。一般应选择年龄适中，无疾病，营养状况良好的动物进行免疫，这样得到的抗体效果更好。另外，选择实验动物时还应考虑血清的用量，如需要量大，可选择山羊等大动物，一般实验室试验，选择兔和鼠即可。应注意的是，在注射抗原前，应采集少量动物血清（阴性血清）和抗原进行血清学反应，选择不和抗原反应的动物进行免疫。
（2）抗原的处理 主要包括抗原的分离提纯、半抗原的改造以及抗原与佐剂的混合等。
抗原的纯度与所制备的抗血清的质量至关重要。如果用纯度不够的抗原免疫动物，就很可能使之产生混合的抗体，最终导致交叉反应，从而影响分析方法的正确性。对于从生物体中提取的免疫原，含有多种复杂成分，纯化过程就显得特别重要。不同的免疫原要求不同的纯化方法，综合起来有盐析法、Sephadex柱分离法、离子交换柱色谱、亲和色谱、电泳等方法。
半抗原分子量小，无免疫原性。若想用半抗原进行免疫，首先要将半抗原与一定的载体连接起来，将其改造成完全抗原后，才可对动物进行免疫。蛋白质是一种高分子胶体两性化合物，一般来说，任何蛋白质都具有很强的免疫原性，并且很容易和半抗原结合，因此，蛋白质是半抗原连接首选的优良载体。
在注射抗原时，往往先将抗原与等体积的佐剂（adjuvant）混合成乳状液后再进行注射。所谓佐剂泛指能提高针对某一种注入体内的免疫原而产生免疫反应的任何物质。目前，动物实验中最常用的佐剂为弗氏佐剂（Freund adjuvant）。它又分为完全弗氏佐剂（complete Freund adjuvant）和不完全弗氏佐剂（incomplete Freund adjuvant）。与佐剂混合后，能使抗原缓慢释放至淋巴系统中，同时扩大了抗原面积，从而增强了抗原的免疫原性。一般来说，实验动物首次注射抗原时，抗原与完全弗氏佐剂混合，而在加强注射时则与不完全弗氏佐剂混合。
（3）动物的免疫 动物免疫过程中应综合考虑的因素包括抗原的免疫剂量、注射途径以及加强免疫的时间和次数。
抗原的剂量应根据抗原的免疫原性强弱、动物的种类和大小等因素确定。抗原的注射量与抗原的免疫原性成反比，与免疫动物的大小成正比。对于大多数动物来说，免疫全过程所需的最佳抗原量在0.1～1.0mg/kg体重的范围。抗原的注射途径有很多，包括肌内、静脉、脾脏、皮下、淋巴结和腹腔注射等。一般地，腹腔、肌内、皮下注射适合于任何抗原，这些途径主要通过刺激局部淋巴结发生免疫应答，初次免疫和加强免疫都可以使用。静脉注射只适用于可溶性抗原和分散的单细胞悬液，其诱发的免疫应答主要发生在脾脏。
为了得到高效价的抗体，在首次免疫后进行多次的加强免疫非常重要。两次免疫注射的时间间隔因动物的大小和抗原的种类不同而不同。通常情况下，小动物的免疫间隔时间为10～14d，大动物为2个月左右。如果免疫原是半抗原，则免疫间隔时间应更长，这主要是因为半抗原分子量较小，难以在短时间内引起免疫反应。
（4）抗血清的采集、保存、纯化与鉴定 当动物经2～3次免疫后，可通过静脉取血，检测抗血清的效价。如果抗体的效价达到理想的水平后，可将动物杀死，通过摘除眼球法、心脏取血等方法获得血液。将血液放置于室温或4℃下凝血，即可获得抗血清。向抗血清中加入0.1％～0.2％的NaN3后，保存于4℃冰箱中，可存放3个月到半年，效价不会损失。
对于获得的抗血清要对其进行效价、亲和力以及交叉反应等参数的测定。效价（titer）是指抗血清或抗体仍能产生可观察到的标准免疫反应时的稀释度。如抗血清的效价为1:1000，即抗血清稀释1000倍时仍能产生可观察到的免疫反应。可见，效价是评价抗血清检测灵敏度的一项重要指标。亲和力（affinity）是表示抗原和抗体结合程度的一项指标，可通过抗原-抗体反应的平衡常数K来表示。交叉反应是衡量抗体特异性的一项重要指标。如果抗体交叉反应程度大，很可能是由于抗原不纯所造成的。交叉反应太大的抗体在免疫检测中无应用价值。
3.2.2 单克隆抗体的制备
抗体主要由B淋巴细胞合成。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，每个B淋巴细胞对应与一种抗原决定簇结合，并产生一种相应的抗体。当机体受抗原刺激后，不同的B淋巴细胞分裂增殖，克隆合成多种抗体，即为多克隆抗体。如果能从不同的B淋巴细胞中选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可以由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆细胞。该单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体（monoclonal antibody）。
单克隆抗体的制备过程非常复杂，可分为：融合脾细胞和骨髓瘤细胞制备杂交瘤细胞、杂交瘤细胞的选择性培养、杂交瘤细胞的筛选与克隆化、单克隆抗体的大量生产以及性质的鉴定。
（1）制备杂交瘤细胞 正常小鼠用抗原免疫后，其脾脏等淋巴组织含大量能分泌特异性抗体的B淋巴细胞。但这些细胞在体外最多只能存活10～20d，因而无法产生大量的特异性抗体。但实验发现，小鼠的骨髓瘤细胞却可以在体外长期存活并大量繁殖。将经免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞以聚乙二醇（PEG）作为融合剂，进行细胞融合，产生的杂交瘤细胞既具有骨髓瘤细胞的无限繁殖能力，又具有B淋巴细胞的遗传信息，能分泌特异性抗体。通过制备这种杂交瘤细胞能实现单克隆抗体的大量生产。
（2）杂交瘤细胞的选择性培养 将脾细胞和骨髓瘤细胞融合，一般只能产生少量的杂交瘤细胞，更多的为未杂交的脾细胞和瘤细胞、脾细胞与脾细胞的杂交细胞以及瘤细胞与瘤细胞的杂交细胞。因此要对融合处理后的细胞进行选择性培养，使非目标细胞死亡，只有由脾细胞与骨髓瘤细胞形成的杂交瘤细胞存活并繁殖。在这里使用的选择性培养基为HAT选择性培养基，在这种培养基下只有目标杂交瘤细胞可以通过正常代谢合成DNA，并大量生长繁殖，而其他细胞将因为无法正常合成DNA或在体外不能长期存活而死亡。
（3）杂交瘤细胞的筛选与克隆化 杂交瘤细胞的筛选与克隆化一般在细胞融合后10d后进行。它是单克隆抗体制备中非常重要的一步。这是因为，一些初生的杂交瘤细胞不稳定，可能丢失染色体，丧失产生抗体的能力，所以需要克隆不断清除变异细胞；融合后的杂交瘤细胞不一定都是所需的目的细胞，需要通过克隆来纯化和确证；在液氮中长期保存的能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞也有丧失分泌抗体的可能，故需通过细胞的不断克隆以纯化目的细胞。筛选克隆细胞的方法包括有限稀释法、显微操作法、半固体培养法和荧光激活细胞分选仪法等。
（4）单克隆抗体的大量生产以及性质的鉴定 获得高纯度的杂交瘤细胞后可进行单克隆抗体的大量生产。其生产的方法大体分为体内产生法和体外产生法。体内产生法是指用健康的雌鼠，最好采用曾多次生产过的雌鼠经注射腹水癌诱发剂后接种杂交瘤细胞以生产腹水抗体的方法；体外产生法是指在玻璃或塑料培养瓶中培养杂交瘤细胞，从培养上清液中提取抗体的方法。一般来说，比起体外法，体内产生法具有抗体浓度高、分泌抗体的能力稳定、生产成本较低等优点。
获得单克隆抗体后，和多克隆抗体一样，也需要对其效价、亲和力以及交叉反应进行分析。另外，还需要对免疫球蛋白的类和亚类以及结合位点等进行分析。
3.2.3 重组抗体
3.2.3.1 重组抗体的概念
在抗体研究的漫长过程中，相继发展了三代不同水平的抗体制备技术。其中以抗原免疫高等脊椎动物制备的多克隆抗体，称为第一代抗体；通过杂交瘤技术生产的只针对某一种特定抗原决定簇的单克隆抗体，称为第二代抗体；应用DNA重组技术和蛋白质工程技术按人们的意愿在基因水平上对抗体分子进行切割、拼接或修饰，重新组装成新型抗体分子，称为重组抗体或基因工程抗体，即第三代抗体。
Kohler等于1975年创立的B淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术，使抗体技术的研究和应用有了重大突破。由此制备出的单克隆抗体是抗单个抗原决定簇的抗体，具有高度的特异性和均一性，且能大量制备。以抗体为载体偶联放射性同位素、毒素和药物的导向药物或“生物导弹”曾风靡全球。但经过了近十余年的研究和临床试验，人们发现这些“导弹”药物离真正的应用还有一段距离。其存在的问题主要有：①鼠源性抗体用于人体后产生人抗鼠抗体（HAMA反应）；②由于鼠单抗是异源蛋白，在体内很快被清除；③由于抗体分子量较大，抗体分子到达靶部位的量不足；④抗体本身的效应功能不强等，这使得传统单克隆抗体技术制备的抗体在应用上受到了极大的制约，无法充分发挥其在疾病防控方面的作用。在20世纪80年代中期出现新技术将免疫球蛋白的基因结构和功能同DNA重组技术结合起来，再将重组后的免疫球蛋白分子基因导入细胞进行表达。由该技术所得的抗体去除或减少了无关结构，保留（或增加）了天然抗体的特异性和生物学活性，降低或基本消除抗体的免疫原性，减低抗体中鼠源成分的同时还可保留原有抗体的特异性。因此，基因工程抗体比天然抗体具有更广阔的应用前景。
3.2.3.2 重组抗体的发展现状
（1）鼠单抗的人源化 针对鼠抗体用于人体后产生HAMA反应，影响靶向性和疗效，以及异源蛋白在人体内被很快清除的问题，可利用分子生物学手段和技术进行鼠抗体的人源化。目前人源化的方法主要有以下三种：
①鼠单抗恒定区的人源化 抗体分子是双功能分子，其与抗原特异性结合的活性存在于轻链和重链的可变区，即Fv段，抗体分子作为异种蛋白诱发免疫反应的抗原性则主要存在于恒定区，因此可将鼠单抗的可变区与人抗体的恒定区进行拼接形成嵌合抗体。这样做可消除大部分鼠异源性，并能够保留亲本鼠单抗结合抗原的特异性和亲和力。目前已批准在临床用于治疗非何杰金氏淋巴瘤的Rituximab就属于此类抗体。
②鼠单抗可变区的人源化 嵌合抗体仅将恒定区换成了人源性，但其仍会保留着30％左右的鼠源序列，可引起不同程度的HAMA。为了降低嵌合抗体的免疫原性，使嵌合抗体更加人源化，产生了CDR嫁接技术（CDR grafting）。抗体分子轻、重链可变区的6个互补决定区（complementarity determinative region，CDR）形成CDR平面直接接触抗原，决定了抗体的特异性，骨架区只是作为支持CDR的支架，而且其立体构象极为保守。因此，将鼠单抗的CDR移植到人单抗的骨架区上，有可能使人单抗获得鼠单抗的特异性，并最大限度地减少鼠单抗的异源性，仅有9％的序列来源于亲本鼠单抗，这种CDR移植的人单抗也称为改型抗体。
③表面氨基酸残基的人源化 虽然改型抗体的人源化程度可超过90％，但要保留亲本抗体的特性有一定困难，因为抗体与抗原结合时，虽然可变区的CRD起很大作用，但抗体骨架区的结构也会通过与CRD相互作用影响分子结构，因此成功的例子不多。近年来计算机建模技术的发展和蛋白质晶体结构数据的不断增加，使表面氨基酸残基“人源化”技术有可能用于抗体的人源化改造。不同种属间免疫球蛋白的CDR长度虽不一致，但暴露于表面的氨基酸残基的位置和数量却很保守。这些表面残基的组成模式在种系内相当保守，而种系间互不相同，这种差异是免疫原性的来源。将鼠轻、重链可变区组成的Fv段表面暴露的骨架区氨基酸残基中与人Fv不同者改为人抗体中的氨基酸，可使Fv的表面残基人源化。表面残基人源化后的鼠单抗保留了亲本抗体的特异性和亲和力，降低了免疫原性。
（2）小分子抗体 抗体分子的抗原结合部位局限在可变区组成的Fv段，从而可以构建分子量较小的具有抗原结合功能的分子片段，称为小分子抗体。小分子抗体具有分子量小、穿透性强、免疫原性低、半衰期短等特点，目前研究较多和比较有实用前景的有以下几种：
①Fab片段 Fab片段由重链Fd段和完整的轻链组成，二者通过一个链间二硫键连接，形成异二聚体，是完整抗体分子的1/3，仅有一个抗原结合位点。利用基因工程的方法，将重链Fd基因与轻链基因5’端接上细菌蛋白的信号序列（signal sequence），所表达的蛋白质在细菌信号肽的引导下可分泌到周质腔，信号肽被信号肽酶（signal piptidase）所裂解，生成的Fd段与轻链的周质腔内完成立体折叠和链内、链间二硫键，形成异二聚体，成为有功能的Fab段。该抗体仅为IgG的1/3，且没有Fc段，免疫原性低，具有良好的穿透力，常用作导向药物的载体和显影。
②单链抗体（ScFv） 在DNA水平上将轻、重链可变区基因用一段适当的寡聚核苷酸（接头）连起来，使之表达成为一条单一的肽链，称为单链抗体。该抗体大小仅为完整IgG的1/6，同时抗原结合位点没有发生变化，因此保留了完整的结合特异性。基于这一优势，ScFv具有更好的组织穿透力，能够进入一般抗体无法到达的部位，在临床应用及疾病治疗中能够得到更好的应用。另外，单链抗体拥有多肽接头，可根据需要设计为具有特殊功能的位点，如金属螯合、连接毒素或药物等，可用于影像和临床治疗。
③双特异性抗体 应用基因工程与化学偶联技术，把识别不同抗原的两种抗体的编码序列进行重新排列，生产出可同时与两种抗原作特异性结合的新型重组抗体，即双特异性单克隆抗体。在这种抗体中，两条臂分别识别两种不同的抗原，其中一个特异性指向体内的效应系统，另一个特异性结合靶抗原，将激活的生物效应桥连于治疗靶标，达到治疗目的。目前其应用的主要目标是肿瘤，其次在感染性疾病研究方面也展示了诱人的前景。
除了以上所介绍的鼠抗体人源性技术和小分子抗体技术之外，重组抗体技术还包括噬菌体抗体库技术、转基因动植物生产抗体技术、核糖体展示技术和mRNA展示技术等。这些技术均使制备抗体变得简单便捷、稳定廉价，为大规模的应用提供了良好的基础。随着分子生物学和免疫学技术的不断发展，基因工程抗体技术将在疾病预防、诊断及治疗上得到越来越多的应用，这可为提高人类生活质量提供强有力的支持。