若以上方法确定某种中药有抗癌作用后，进一步就是探求其抗癌作用的机制。抗癌作用的靶点很多。有的阻碍核酸合成，如甲氨蝶呤抑制二氢叶酸还原酶，使四氢叶酸生成不足，因而脱氧胸嘧啶核苷酸生成障碍；氟尿嘧啶与尿嘧啶相似，故可竞争性抑制胸苷酸合成酶，使DNA合成受阻；巯嘌呤干扰嘌呤代谢，阻碍嘌呤核苷酸合成；羟基脲阻止胞苷酸还原为脱氧胞苷酸，抑制DNA合成；阿糖胞苷抑制DNA聚合酶。有的抗癌药破坏DNA结构和功能，如烷化剂与DNA和蛋白分子中的氨基、巯基、羧基、羟基和磷酸基起烷化反应，以烷基取代上述基团中的氢原子，破坏DNA和蛋白质的正常结构与功能；博来霉素在腺嘌呤与胸腺嘧啶配对处与DNA结合，引起DNA链断裂；喜树碱类干扰DNA拓扑异构酶，抑制DNA复制。有的药物嵌入DNA而干扰RNA转录，如放线菌素D等能插入到G-C碱基对，与双链DNA牢固结合，抑制所有形式的DNA依赖性RNA转录。有的抗癌药作用于蛋白质，影响纺锤丝形成和功能（如长春新碱），或干扰核蛋白体功能（如三尖杉酯碱），或影响氨基酸的供应（如L-门冬酰胺酶降解门冬氨酸为天冬氨酸和氨，使肿瘤缺乏门冬酰胺而蛋白合成障碍）。此外，还有激素类和影响激素平衡而抑制肿瘤的药物。

中药的抗癌作用可能是多靶点的。例如姜黄素有抗炎、抑制血管生成、抗氧化等作用，抑制细胞周期中的几种信号转导路径，包括与蛋白激酶C有关的转导和转录因子NF-κB。目前发现姜黄可以上调22种基因和下调17种基因的表达，其中包括原癌基因。这些基因与细胞增殖周期、细胞凋亡等有关。

以下介绍几种抗癌靶点及其研究方法：

基因表达的产物是蛋白质，而蛋白质可用蛋白质印迹法来分析。一种药物是否影响细胞基因表达可以利用蛋白质印迹法显示其蛋白产物量来分析。以下用姜黄素下调癌基因cyclin D1的表达为例来介绍这种方法。

周期蛋白（cyclin）分别在细胞周期的不同时期程序性地表达。目前发现的周期蛋白有8个成员（A~H），在G ₁期表达的cyclin D1~D3、cyclin E是原癌基因，在多种癌细胞中都有过度表达。Cyclin D1表达产生的蛋白质称为cyclin D1蛋白。有一些磷酸激酶的活化是依赖这种蛋白的，称为cyclin D1蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases，CDK）。激酶利用ATP的能量和磷酸使一些蛋白质包括酶蛋白磷酸化，如蛋白激酶C能磷酸化相当多的蛋白质，包括：①代谢途径中的关键酶类，如糖原合成酶、磷酸化酶激酶、HMG CoA还原酶等；②与信息转导有关的蛋白质，如GTP酶活化蛋白、Raf蛋白激酶；③调控基因表达的转录因子或与翻译有关的因子，如c-fos，nuclear factor-kappaB（NF-κB），与DNA合成有关的拓扑异构酶Ⅰ等。由蛋白激酶C调控的基因中有一段序列TGAGTCA，称为TPA反应组件（TPA response element，TRE）。TPA是12-O-tetradecanoyl phorbol-13 acetate的缩写，有促癌作用，能直接启动蛋白激酶C而磷酸化核内磷酸酶，磷酸酶启动后，水解掉核内蛋白Jun的几个磷酸基，Jun即可与TRE结合而促进基因表达，这可能是TPA的促癌机制。

研究发现，姜黄素能下调cyclin D1的表达。方法是将两组等量的癌细胞进行培养，其中一组培养液中加姜黄素，然后制备细胞提取物，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，进行电转移，用抗cyclin D1蛋白的抗体（1∶1000稀释）做探针处理2小时，分离得到与该抗体结合的cyclin D1蛋白，用光化学物标记的抗免疫球蛋白作为第二抗体与上述抗原抗体复合物结合而显示cyclin D1蛋白的量。为了确保各份标本中加入的第二抗体量相等，用抗β-肌动蛋白（β-actin）的抗体作对比。比较未经姜黄素处理的培养细胞和经姜黄素处理的培养细胞的cyclin D1蛋白的量，结果显示姜黄素以剂量依赖方式和时间依赖方式下调原癌基因cyclin D1的表达（图3-3）。

视网膜母细胞瘤基因（retinoblastoma gene，Rb）是最早发现的肿瘤抑制基因。其表达产物视网膜母细胞瘤蛋白（Rb蛋白）与转录启动因子E-2F形成复合物，使E-2F处于非活化状态。Cyclin D-依赖性蛋白激酶（CDK4）使Rb蛋白磷酸化而与E-2F解离，E-2F因而活化，促使细胞从G ₁期向S期转化，导致DNA合成增加，细胞增殖。

中药若下调原癌基因的表达，减少cyclin蛋白的产生，影响cyclin蛋白依赖性激酶的活性，可使Rb蛋白的磷酸化减少，抑制DNA合成和癌细胞增殖。研究方法是：经中药处理的培养癌细胞被溶解，细胞碎片被离心，取一定量的细胞蛋白与抗CDK4的抗体做免疫沉淀反应，离心，用缓冲液洗涤，得到CDK4，与底物Rb蛋白在加有 ³²P标记的ATP的环境中孵化，然后用10%SDSPAG分离蛋白，用放射性自显影检测被磷酸化的Rb蛋白的量（图3-4）。

研究方法是：从经中药处理的培养癌细胞中提取mRNA，逆转录成cDNA，经一定循环次数的PCR扩增，用溴化乙啶作荧光标记显示PCR产物量，以反映mRNA转录量，从而检测cyclin D1、cyclin D2、cyclin D3和cyclin E的转录（图3-5）。

Cyclin D1 cDNA的PCR扩增所用引物是5′-CGGGATCCCCAGCCATGGAAC ACCAGC-3′和5′-CGGAATTCGCGCCCTCAGATGTCCACG。

微管也是抗癌药的作用靶点之一。如长春新碱（vincristine）、鬼臼毒素（podophyllotoxin）能与微管蛋白相结合，抑制微管聚合而阻碍纺锤丝的形成，抑制细胞分裂，是作用于M期的周期特异性药物。紫杉醇（paclitaxel）促进微管蛋白聚合而抑制其解聚，从而影响纺锤体的功能，使癌细胞分裂中止于G ₂/M期。微管蛋白在0~4℃是无色透明溶液。当温度升高并恒温于37℃时，微管蛋白聚合，溶液浊度逐渐增加，在350nm波长的OD值增大并在37℃恒温时趋于稳定。而当温度由37℃降至0℃的过程中，微管蛋白解聚，溶液浊度下降，光密度减少并在0℃恒温时趋于稳定。根据微管这一特性，比较对照管和加药处理管，可测试药物有无促进微管聚合或解聚作用。

GADD是抗癌作用的又一靶点。GADD34、GADD45和GADD153在缺乏营养如葡萄糖、亮氨酸、锌或细胞暴露于紫外线、抗癌药等情况下，往往会增加表达，导致细胞生长停滞和细胞凋亡。有研究发现，姜黄上调GADD153的表达。其研究方法是：培养癌细胞与药物孵化后，总RNA被提取，用针对靶基因GADD153的特异引物作RT-PCR分析。用β-actin基因作内部对照（图3-6）。

以上介绍了欧美医学科学家对植物药抗癌作用的部分现代实验研究方法学。这些研究方法是很有价值的。但是仅用西医药理学的方法来研究中药是不全面的，中药的临床应用还应遵循经数千年观察和反复俢正而形成的、行之有效的一些中医理论如整体观念、扶正祛邪（即增强器官功能特别是免疫系统来对抗疾病）、个体辨证、药物配伍等，才能取得较好的临床效果。