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一、如何确定药物是否具有抗癌作用的实验研究方法
在众多声称有抗癌作用的植物药中如何选定值得研究的对象?通常是根据历史文献记载和临床报道提供的线索,进行分析,或根据民间经验和流行病学调查分析筛选研究对象。例如近年欧美医学家通过流行病学调查分析发现姜黄可能有预防和治疗癌症的作用,因而兴起了姜黄研究热。
一个药物(无论西药或中药)是否有杀灭或抑制癌细胞的作用,常用下列方法确定:
(一)MTT法
MTT(5-diphenyl tetrazolium bromide)为黄色物质,可被细胞中与辅酶Ⅱ(NADP)相关的脱氢酶还原为紫蓝色的不溶性甲 (formazan)。癌细胞死亡则此酶消失,MTT不被还原。用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解甲 ,可用酶标仪在550nm波长处检测光密度(OD),测知MTT被还原的量。据此反映细胞死亡的量。例如培养癌细胞经姜黄素处理过后,与未经姜黄处理的培养癌细胞相比,MTT被还原量明显减少,反映姜黄素使大量癌细胞死亡。MTT法还被用于中药复方抗癌作用的研究。
(二)SRB法
这是美国癌症研究所采用的方法。磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)是溶于水的粉红色染料,可与生物大分子中的碱性氨基酸结合,在515nm的OD读数与细胞数呈良好线性关系。以此比较加药前后的细胞数,可知细胞生长有无受到抑制。通过测定对照组细胞、加药组细胞的光密度(OD)值和加药时的OD值,可计算岀药物有无抗癌作用及50%生长抑制所需的药物浓度(GI 50)和杀死50%癌细胞所需药物浓度(LC 50)。近年,加利福尼亚大学外科系Shoemaker和Hamilton等用这种方法发现12种中药具有抗癌作用。这种方法也被用于中药复方的研究。
(三)胸腺嘧啶核苷渗入法
胸腺嘧啶核苷是DNA合成的原料之一。用放射性同位素标记胸腺嘧啶核苷,测知胸腺嘧啶核苷渗入DNA的量,可反映细胞增殖的情况。例如用 3H标记的胸腺嘧啶核苷加入癌细胞培养液,测定细胞DNA合成时胸腺嘧啶核苷渗入的量,亦发现经姜黄素处理可使胸腺嘧啶核苷渗入量明显减少,反映姜黄素使DNA合成障碍,癌细胞大量死亡。
(四)细胞凋亡的观察
药物能否引起癌细胞凋亡可通过光学显微镜观察、核小体间DNA裂解检测或流式细胞仪检查发现。
作为细胞死亡的形式之一,细胞凋亡的形态学特点是细胞核固缩,染色体DNA广泛断裂,沿核膜浓聚成多形性高密度颗粒区,核膜皱缩;核膜崩解后包裹染色体片段形成凋亡小体散布于细胞质。这些变化可用光学显微镜观察发现。
核小体间DNA裂解检测的原理是凋亡细胞的DNA断裂形成大小不等的DNA片段(核小体单位),在琼脂糖凝胶电泳上呈现间隔180~200碱基对的特征性“DNA梯”(图3-1A泳道2),而细胞坏死则不会有这样的DNA梯(图3-1A泳道3)。
图3-1 经姜黄素处理的黑色素瘤细胞(B16-R)DNA分析(OdotJ等,2004)
细胞(2×10 6)在姜黄素处理前培养12小时。从细胞提取的DNA(20µg/well)用1.8%琼脂凝胶作电泳分析
A.DNA分子量用碱基对(bp)标示(泳道1)。泳道3为对照组细胞的DNA。泳道2和泳道4分别为经100µmol和200µmol姜黄素处理24小时的B16-R细胞的DNA。B.泳道1和4为DNA分子量标示。泳道2和3分别为经100µM和200µM姜黄素处理48小时的B16-R细胞DNA
由于凋亡细胞DNA广泛岀现许多不对称断裂点,利用末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)在众多游离3′-OH端引入与荧光素偶联的dUTP作标记,可用流式细胞仪检测细胞凋亡。未凋亡的细胞因为没有暴露的3′端,所以不会被检出。这个方法称为TdT介导的dUTP缺口末端表示法(TdT mediated-dUTP nick end labeling,TUNEL)。西方医学界在研究中药抗癌作用时也用了这种方法观察中药能否引起癌细胞凋亡(图3-2)。
图3-2 用流式细胞仪和TUNEL法检测中药复方SPES或(和)阿霉素引起的胰腺癌细胞凋亡
(Schwarz RE等,2003)。横坐标为TUNEL-阳性的百分比