第九章　蛋白质水平耐药机制

第一节　细菌产生的抗生素灭活酶

细菌产生抗生素灭活酶是细菌耐药最常见的机制之一。细菌通过耐药因子的水解或修饰作用，破坏抗生素的结构使其失去活性。抗生素灭活酶有两种：一种是产生水解酶，如β-内酰胺酶；另一种是产生钝化酶，如氨基糖苷类钝化酶。

一、β-内酰胺酶

（一）概念及分类

β-内酰胺酶（β-lactamase，BLA）主要是革兰阴性菌产生的水解β-内酰胺类抗生素的酶。BLA通过破坏β内酰胺环，改变抗生素的构象，使之失活，导致青霉素类、头霉素类和碳青霉烯类等β-内酰胺类抗生素耐药。

BLA的分类方法比较复杂，可按氨基酸序列、功能、分子生物学特性，包括等电点、酶作用底物和被克拉维酸抑制等方法进行分类。其中最常用的分类法是Ambler-Bush法，即按酶作用底物是否被克拉维酸抑制及氨基酸序列分析分类法。另外，根据底物特异性的不同BLA可有不同名称：青霉素酶、头孢菌素酶、碳青霉烯酶、金属酶和苯唑西林酶等。

（二）β-内酰胺酶的理化性质、分子结构和作用机制

β-内酰胺酶的分子量一般在14～49kDa之间，pI为4.3～10.5，革兰阳性菌和革兰阴性菌最适pH分别为6.7～7.0和5.0～8.5，以青霉素为底物的活化酶分别为7.2～8.8和3.2～5.2Kcal/mol，最适温度范围为30～55℃。

Ambler分类的四种A、B、C、D中A、C、D类酶的活性位点上都有丝氨酸，故又称为活性位点丝氨酸酶，其以丝氨酸为中心，周围有几段高度保守的氨基酸序列，共同组成活性中心的腔状结构，以便与β-内酰胺环反应。而B类酶的活性中心含有锌离子，与周围氨基酸如组氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸等通过配位键相连接，共同作用于水分子导致水解反应的发生。比如，青霉素酶分解青霉素类抗生素和第二代头孢菌素，头霉素酶主要分解头霉素，而苯唑西林酶既分解苯唑西林也水解青霉素类抗生素，金属酶主要水解碳青霉烯类抗生素等。

（三）几种代表酶

1.超广谱β-内酰胺酶（extended spectrum β-lactamases，ESBLs）ESBLs是由肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌为主的G-杆菌产生，由质粒介导的、能赋予细菌对多种β-内酰胺类抗生素耐药的一类酶，是当前最受关注的一类β-内酰胺酶。此类酶能水解头孢噻肟、头孢他啶和氨曲南，部分产ESBL的菌株同时对氨基糖苷类和氟喹诺酮类耐药。大部分ESBL分子结构为A类，可分为两个亚群，即TEM和SHV类ESBL及非TEM和SHV类ESBL。

（1）TEM和SHV类ESBL（Class A）：TEM型ESBL最初发现于一株大肠埃希菌，由于携带该菌株的患者叫Temoniera而得名。SHV则是Sulphydryl Variable的缩写。TEM-1、TEM-2和SHV-1都是广谱β-内酰胺酶，可由一个或多个氨基酸的改变，转变为ESBL。TEM型酶数量最多，已发现170种以上，SHV型酶也有120余种。这些酶的活性中心均有丝氨酸残基。TEM型等电点在5.1～6.5之间，SHV型等电点一般在7.0～8.2之间。

（2）CTX-M类ESBL（Class A）：CTX-M是近年流行最广泛的ESBLs类型，已现90多种类型（http：//www.lahey.org/studies/other.asp）。CTX-M类ESBLs是编码291氨基酸的酶，单个氨基酸发生改变，就可以形成一个新的亚型。

CTX-M型ESBL能高度水解头孢噻肟，而对头孢他啶和头孢曲松的水解能力较低，也水解氨曲南，对他佐巴坦敏感，对舒巴坦和克拉维酸耐药是所有CTX-M型酶的一个特点。这类酶与SHV和TEM酶类不同，其活性部位并不影响药物的抗菌活性，氨基酸序列的点突变更能导致特异性的相互作用，进而增强头孢噻肟和头孢他啶的活性。若细菌同时拥有CTX-M和SHV或CTX-M和AmpC酶时，可能改变其耐药特征。

（3）OXA型酶（Class D）：又称苯唑西林酶（oxacillinase），因有效分解苯唑西林（Oxacillin）故简称OXA。OXA基因主要位于质粒或整合子上，其氨基酸序列与A、C类酶有16%的一致性。该类酶对酶抑制剂不敏感，但100mmol/L的氯离子（常用NaCl）能强烈抑制其活性。这类酶主要存在于铜绿假单胞菌和肠杆菌科细菌，通常介导氯唑西林、苯唑西林和甲氧西林的耐药（如OXA-1、OXA-2和OXA-3）。随着基因突变，新产生的一些OXA型酶的底物谱发生了变化，出现了能水解碳青霉烯的OXA型酶（如OXA-23，24，25，26，27）和超广谱的OXA型酶。

2.金属β-内酰胺酶（metallo-β-lactamases，MBLs）简称金属酶，属Ambler B类，Bush分类为第3组，按基因编码序列相似度，又分为三个亚类：B1、B2和B3（见表9-1）。MBLs具有广泛的底物谱，广泛水解除单环类β-内酰胺类抗生素以外的所有β-内酰胺类抗生素，其活性需要金属离子（Zn2+）介导，不被现有的β-内酰胺酶抑制剂抑制，但可被EDTA等金属螯合剂抑制，表现出结构和作用机制的多样性，使其介导的抗生素耐药性很难被克服。金属酶主要在蜡状芽孢杆菌、脆弱类杆菌、黏质沙雷菌和铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌等革兰染色阴性杆菌产生。

NDM-1（New Delhi metallo-β-lacatamse 1）是近年新发现的一种金属酶，此酶可以使碳青霉烯类和其他β-内酰胺抗生素如青霉素失去功效，使细菌对大多数抗菌药物包括β-内酰胺类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、大环内酯类和喹诺酮类等产生广泛耐药性，仅对多黏菌素和替加环素敏感，故产NDM-1的细菌又称为超级细菌（super bacteria）。NDM-1是被英国卡迪夫大学的蒂莫西·沃尔什在肺炎克雷伯菌中首次发现。NDM-1最为棘手的一点是容易定植在肠道细菌中，可以在细菌中自由复制和移动，从而使这种细菌拥有传播和变异的惊人潜能。目前，产NDM-1的主要菌种为大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，其他细菌还有不动杆菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、变形菌、弗氏柠檬酸菌、产酸克雷伯菌、摩根摩根菌、普罗威登菌等。2010年Lancet杂志上报道，英国和印度广泛流行携带NDM-1的细菌，给临床感染治疗带来很大困难，NDM-1酶通过质粒水平传播，空中旅行和移居也可使这些细菌在不同国家间进行水平传播。

3.AmpC类β-内酰胺酶 AmpC是根据其耐氨苄西林（ampicillin）再加上其分子类别“C”类而命名，是耐氨苄西林大肠埃希菌中发现的一种染色体基因编码的β-内酰胺酶Ampicillin再。AmpC是由G-杆菌产生的、不被克拉维酸抑制的丝氨酸类头孢菌素酶组成的一个酶家族。该基因不仅存在于染色体上，而且也存在于质粒上。由染色体介导的AmpC酶已有53种，由质粒介导的已有19种。染色体介导的AmpC酶不被克拉维酸抑制，且能水解第三代头孢菌素等β-内酰胺类抗生素。目前被分为四种，见表9-2。

质粒介导的AmpC酶对第一至第三代头孢菌素，头霉素，氨基糖苷类及抗假单胞菌青霉素均耐药，但对碳青霉烯类，第四代头孢菌素和氟喹诺酮类敏感。在2002年首次报道了一种同时产ESBL和AmpC酶的沙门菌分离株，这类菌株被命名为ESBL产生株，该类菌株的耐药性更强，更易传播。质粒介导的AmpC酶，与染色体编码的AmpC酶具有不同程度的同源性（37%～99%），质粒介导的ampC没有调控基因，呈持续性高表达，且有快速复制和可转移的特点，易产生更多的耐药菌株。

二、氨基糖苷类抗生素钝化酶

临床上细菌对氨基糖苷类产生耐药的最重要原因是修饰酶的产生，抗生素的氨基（-NH2）或羟基（-OH）被酶修饰后与核糖体结合不紧密而不能进入下一阶段发挥抗菌作用，使细菌在抗生素存在的情况下仍能存活。细菌在接触氨基糖苷类抗生素后产生修饰酶使后者失去抗菌作用，常见的氨基糖苷类修饰酶（aminoglycoside modifying enzyme）有乙酰转移酶（acetylase，AAC）、腺苷化酶（adenylase，AAD）、核苷化酶（nucleotidylase，ANT））和磷酸化酶（phosphorylase，APH）。少数钝化酶基因位于染色体上（如黏质沙雷菌和铜绿假单胞菌），多数菌种特别是肠杆菌科细菌的酶基因位于质粒或转座子上，并常和ESBLs相关联，导致多重耐药。

（一）氨基糖苷类钝化酶的命名及分类

氨基糖苷修饰酶的命名遵循下列原则：AAC、AAD、APH、ANT等表示酶的修饰类型，写在其后的（1）、（2）等表示修饰位置；I、Ⅱ等表示一种抗性谱；a，b等表示不同的蛋白质。编码这些酶的基因名称引用Mitsa-hashi基因型名称，如aac（6′）-I-a。各种氨基糖苷钝化酶的类型及其耐药谱见表9-3。

（二）氨基糖苷类钝化酶的主要类型

至今在革兰阳性球菌中发现的修饰酶有5种，它们是ANT（6）-Ⅰ、ANT（9）-Ⅰ、APH（3′）-Ⅲ、ANT（4′）-Ⅰ和AAC（6′）/APH（2″）（仅存在于革兰阳性菌）。其中APH（3′）-Ⅲ、ANT（4′）-Ⅰ和AAC（6′）/APH（2′）具有重要意义，因为它们分别钝化临床上常用的卡那霉素、妥布霉素和庆大霉素。革兰阴性菌中常见的酶是APH（3′）、AAC（6′）和AAC（3）。其中APH（3′）占比例最高（58%），其次为AAC（6′）（38%）。

（1）AAC（6′）：

能修饰临床上多数氨基糖苷类抗生素，是目前最常见的宽谱酶。革兰阳性和革兰阴性菌均产生此酶。可以是染色体编码，也可是质粒编码，一部分是可移动的基因元件（mobile genetic elements），已在细菌中发现该酶的24种亚型。在已知的AAC（6′）中AAC（6′）-Ⅰb是革兰阴性菌中最常见的，临床上约70%的革兰阴性菌有此活性。

AAC（6′）-Ⅰ对阿米卡星、妥布霉素、奈替米星、卡那霉素、异帕米星，和地贝卡星等耐药。用DNA杂交已在革兰阴性菌染色体中发现了一些编码基因，如aac（6′）-Ⅰk，aac（6′）-Ⅰf，aac（6′）-ⅠC，aac（6′）-Ⅰz，AAC（6′）-Ⅰi，aac（6′）-Ⅰm。AAC（6′）-Ⅰe是双功能酶AAC（6′）-Ⅰe-APH（2″）-Ⅰa的N端部分。此双功能酶的基因广泛存在于革兰阳性菌的转座子Tn400上。两个功能区结构相连，却不相互加强抵抗活性，但破坏了两个功能区结构的完整性，可以明显抑制各自的活性。对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的研究发现5′端临近区的12bp缺失导致该双功能酶的过度表达。

AAC（6′）-Ⅱ只发现了两种，主要产生对庆大霉素、妥布霉素、奈替米星、西索米星的耐药，但不产生对阿米卡星的耐药。AAC（6′）-Ⅱa和AAC（6′）-Ⅱb首先在铜绿假单胞菌和荧光假单胞菌中发现，表现对庆大霉素、妥布霉素、奈替米星、地贝卡星和西索米星耐药。

（2）APH（3′）：

多数APH在3′位修饰羟基，现已经发现7种不同的APH（3′），即APH（3′）-Ⅰ～APH（3′）-Ⅶ，磷酸化产物缺乏抗生素活性。①APH（3′）-Ⅰ产生对卡那霉素、新霉素的抗药性，见于大肠埃希菌，肺炎克雷伯菌、肠炎沙门菌、霍乱弧菌和空肠弯曲菌等革兰阴性菌，，也见于革兰阳性条件致病菌（棒状杆菌）。②APH（3′）-Ⅱ与APH（3′）-Ⅰ具有相似的耐药谱，临床上却少见。③APH（3′）-Ⅲ磷酸转移酶的编码基因为aph（3′）-Ⅱ，可在革兰阳性和阴性菌间转移。APH（3′）-Ⅲ产生对卡那霉素、新霉素、核糖霉素和阿米卡星等的耐药。④APH（3′）-Ⅳ和APH（3′）-Ⅴ仅在抗生素的微生物中发现。⑤APH（3′）-Ⅵ对阿米卡星、卡那霉素、新霉素、核糖霉素等耐药，其编码基因主要在不动杆菌中发现。⑥APH（3′）-Ⅶ产生对卡那霉素和新霉素的耐药，其编码基因在空肠弯曲菌中找到，但其基因分布尚不清楚。

（3）APH（3″）和APH（6）：

APH（3″）和APH（6）分别修饰链霉素的3″-和6-羟基。编码APH（3″）-Ⅰ有两个基因，aph（3″）-Ⅰa见于产链霉素的链霉菌，aph（3″）-Ⅰb可从革兰阴性菌的质粒RSF1010中找到。尽管这两种酶在不同的细菌中发现，但它们有50%的氨基酸相同、68%同源性。链霉素产编码APH（6）-Ⅰd的基因也从质粒RSF1010中找到，而此质粒也存在于APH（3″）-Ⅰb。联合基因aph（3″）-Ⅰb-aph（6）-Ⅰd在植物和动物的病原菌中均可见到，植物中主要与大接合质粒的转座子相关，见于解淀粉欧文菌、草生欧文菌和野生黄杆菌。人和动物病原菌的aph（3″）-Ⅰb-aph（6）-Ⅰd联合基因与革兰阴性菌的小非接合质粒相联系。

三、其他酶类

（一）红霉素酯酶和大环内酯2′-磷酸转移酶

这两种酶由肠杆菌科细菌产生，能破坏十四元环大环内酯类的内酯环，但不破坏十六元环类的结构。酯酶耐药基因为ereA和ereB，分别编码酯酶Ⅰ和酯酶Ⅱ，它们仅限于革兰阴性杆菌。肠杆菌科中，ereA常与ermB同时存在，导致细菌对红霉素的高水平耐药，表明两酶之间有协同作用。临床上对林可霉素的高水平耐药多由磷酰转移酶引起，这种酶已在葡萄球菌中检出。Wondrack等发现一株金黄色葡萄球菌可灭活十四、十六元环大环内酯类抗生素，其分解产物与具有ereA或ereB的大肠埃希菌分解产物相仿，故推测也是一种酯酶，只是它们的分解能力不同。

（二）达福普丁乙酰转移酶和奎奴普丁水解酶

达福普丁乙酰转移酶和奎奴普丁水解酶这两种酶分别从金黄色葡萄球菌和溶血葡萄球菌中发现，可破坏链阳菌素结构而致耐药。

（三）林可酰胺核苷酸转移酶

林可酰胺核苷酸转移酶也是葡萄球菌产生的一种酶，可导致对林可胺类耐药。细菌可产生氯霉素乙酰转移酶（chloramphenicol acetyltransferase，CAT）灭活氯霉素；产生酯酶（esterase）灭活大环内酯类抗生素；金黄色葡萄球菌产生核苷转移酶（nucleotidyltransferase）灭活林可霉素。