第四节 整合子介导耐药
整合子（integron）是一种能捕获并表达外源基因的移动性基因元件，具有位点特异性的基因重组系统。目前常引起细菌抗生素耐药性的播散。
一、整合子的结构与分类
（一）整合子的结构
整合子大小一般为800～3900bp，5′末端序列（5′conserved segment，5′CS）为整合子高度保守的核心区，编码DNA整合酶基因（integrase，intI），其编码产物整合酶（IntI）是酪氨酸重组酶家族，IntI可催化外源基因盒与整合子重组位点attI之间的重组，并通过整合子上的保守区启动子（Promoter，Pant）得以启动表达，3′端由高度可变的结构基因区组成，包括1个或多个基因盒的中心序列。故又称基因盒-整合子系统（图8-5）。
图8-5 整合子结构示意图
P1、P2：启动子；int：DNA整合酶基因；attI：基因盒整合位点；attC：59be重组位点
基因盒（gene cassettes）是整合子捕获的外源基因的一部分，这些基因通常结构简单，有单一的开放阅读框（ORF），通过位于3′末端的位点特异性的59碱基单元（59 base element，59 be）保守区，与整合子的attC位点发生重组，结合于整合子上，基因盒attC的交换位点从57～141个碱基不等，但其5′端与基因盒基因编码区3′反向核心序列RYYYAAC为界，3′端则与核心序列（GTTRRRY）为界（R：嘌呤，Y：嘧啶），中间含有1个60bp的共同序列，为不完全的反向重复序列（图8-6）。外源基因整合后，通过整合子上启动子的作用得以表达。目前，在第Ⅰ型整合子中发现的基因盒已超过130种，并且有新基因盒不断被发现。
图8-6 基因盒结构
G：鸟嘌呤；A：腺嘌呤；T：胸腺嘧啶；C：胞嘧啶；R：嘌呤；Y：嘧啶
整合子系统在推动细菌基因组进化上具有重要意义。首先，新的遗传物质通过特异性的重组位点attI整合到细菌的基因组上，不会干扰细菌正常的编码基因表达。另外，新的被整合的基因是通过整合子的启动子表达的，因此细菌可选择性的启动对自身生存更为有利的基因，进而趋利避害。
（二）整合子的分类
根据整合子int I基因DNA编码序列的差别，将目前临床研究较多的整合子分为以下四类：Ⅰ型整合子（Class Ⅰ integrons）最常见，出现在临床菌株中（如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌等革兰阴性杆菌和革兰阳性棒状杆菌）及非致病菌的基因组中。其整合酶IntI1包含337个氨基酸，5′端有编码IntI1的107bp的基因intI1、重组位点attI1和启动子Pant。其中Pant位于IntI1的编码框内，有的整合子还含有启动子P2，这类整合子的整合酶可以催化其他类型基因盒的整合，3′端有编码43bp的保守attC片段，有报道称在生物膜和淡水环境中分离到的Ⅰ型整合子可携带qac基因，该基因家族编码介导细菌耐药的多药外排泵基因。Ⅱ型整合子（Class Ⅱ integrons）位于Tn7转座子及其衍生物上，常在农业生境的相关菌株中被发现，如硬壁菌和拟杆菌等，临床分离的该整合子的整合酶基因intI2被一个终止密码子中断，并存在一些内源性的基因突变位点，是缺陷的整合酶基因，它的产物IntI2约有318个氨基酸，与IntI1有40%的同源性，因此，使IntI2不能催化基因盒的整合、重排与剪切。Ⅲ型整合子（Class Ⅲ integrons）最初由日本学者在碳青霉烯类抗生素耐药的黏质沙雷菌的质粒上鉴定，后来发现此类整合子也可被Tn402转座子捕获，其整合酶IntI3包括346个氨基酸，与IntI1约有60.9%的同源性。另外，Ⅳ型整合子是在霍乱弧菌基因组中出现，其整合酶有320个氨基酸，与前三型整合子的整合酶基因同源性均较低，此类整合子的可变区因携带有上百个基因盒，故又称为超级整合子（super integron，SI）。SI基因盒中除含有耐药基因外，还含有介导细菌的代谢及编码毒素、血凝素和脂蛋白的致病基因。
二、整合子与细菌耐药性
（一）整合子与细菌耐药性的关系
移动性的整合子与细菌耐药性的水平转移密切相关，特别是在革兰阴性菌中。基因盒携带的基因多为抗菌药物耐药基因簇，其中多种编码氨基糖苷类、β-内酰胺类、氯霉素、TMP以及一些化学消毒剂等的抗性基因包含在可移动的基因盒中。目前，约有130种编码抗生素抗性的基因盒被鉴定，由于其不同的编码模式以及attC位点特异性，一个整合子可从细菌不同的生存环境中捕获1个或多个基因盒，移动性整合子中的基因盒通常编码序列很短，最多可蓄积8个基因盒。被捕获的基因盒5′-端与attI结合，3′-端的59be与attC（59be重组位点）发生位点特异性重组，成为整合子的组成部分。attC结构为基因盒的插入及表达提供了重要的结构基础，耐药基因盒可以从一个整合子转移到另一个整合子上，使整合子中耐药基因不断积累，成为多耐药整合子。起始密码子位于基因盒的一端，通常不含启动子结构，但可从整合子的一个共同启动子Pant开始表达。耐药基因的表达水平受启动子变异和基因盒插入部位的影响。然而，整合子与细菌耐药性的关系并不是基因盒-整合子系统内源性的特征，而是在人类使用抗生素的强大选择压力下进化而来的。
（二）整合子、基因盒的转移与表达
整合子的移动包括两种含义，一是整合子在质粒、转座子、染色体之间的移动；二是整合子可特异性捕获或切除基因盒，导致基因盒的移动。同一基因盒可整合于不同的整合子上，一般线性的基因盒被切割下来后，由于基因两端的特殊结构可相互连接，导致游离的基因盒以闭合环状结构存在，如通过整合酶IntI催化，以线状结构结合于特异的交换位点attI和attC之间的基因盒，这种形式的特异性整合是可逆的。少数游离的基因盒也可由IntI催化，但它不结合于attI和attC特异位点上，而是结合于整合子的非attI-attC或attC-attC交换位点（第2位点）上。这种形式为非特异性整合，非特异性整合是不可逆的。细菌一旦非特异性地整合上基因盒，就使其永久性获得新基因，这对基因盒在细菌间的传播以及细菌质粒和基因组的进化有重要意义。
由于大多数基因盒都不含有启动子，故基因盒的表达需依赖于整合子上的启动子。当线性基因盒整合于位点attI上，包括多个基因盒在内，只存在一种方向（5′→3′）排列，这种向位特异性有利于启动子启动所有下游的基因盒的表达。5′-保守末端区的Pant是主要启动子，少数整合子在其下游位置尚有P2启动子，属强启动子。当Pant突变为弱启动子时，则P2就成为基因盒表达的主要启动子。基因盒表达除了与启动子自身的强弱有关外，还与插入的基因盒靠近启动子的距离有关，最靠近启动子的基因盒的表达水平最强，而下游的基因盒表达水平逐渐减弱。如果基因盒整合在第2位点（非特异整合），基因盒的表达需依赖于整合子上适当方向的启动子。极少数基因盒自身含有启动子和翻译弱化信号，如与氯霉素耐药性有关的CmlA基因盒，在亚抑制浓度的氯霉素诱导下，自身启动子可致CmlA表达。由于大多数基因盒都是耐药基因，并且1个整合子可捕获多个基因盒，因此可表达出对不同抗菌药物的多重耐药性；另外，基因盒-整合子系统为可移动基因元件，位于细菌的质粒或染色体上，对耐药性在细菌间传播产生重要影响。
目前，许多临床分离菌株都携带抗生素耐药整合子，以致在革兰阴性杆菌中约有43%的细菌含有Ⅰ型整合子，可表现出对氨基糖苷类、喹诺酮类及第三代头孢菌素类药物的耐药性，并且常介导多重耐药性。整合子也可存在于临床耐药菌株质粒和转座子等移动元件上，能在不同细菌间转移。自然界环境中，包括人体正常菌群都存在一个相当大的抗生素耐药基因池，细菌复制子及其宿主之间的“基因流”是经常性的而非偶然产生的，当病原菌暴露于强大的抗生素选择压力下，这个基因池可随时对细菌开放，使细菌迅速摄取耐药基因并获得强大的耐药性。
（马淑霞 王春敏 付英梅 陈杨）