第三节　耐药性的进化：未来展望

一、变异单位与选择单位

进化是对个体变异的选择过程。这里所说的个体不仅指单个细胞、单个动物或植物，而是指能够生存、复制、自身重构、逃避或推迟死亡的简单或复杂的结构。个体之间相互作用形成了由简单到复杂的不同层级的个体。任何层级上都可能发生变异，从某种意义上说，个体也是变异的单位。现代层级进化理论认为不同整合水平上的各种个体都是选择力的独立作用对象，这为进化提供了一个新视觉，被称为超级达尔文主义。超进化论提醒人们，进化不仅发生在生物个体和物种的水平，而且发生在个体以上和以下的水平。

个体以下水平的进化（suborganismal evolution）可能涉及多肽和蛋白质等分子，还可能涉及基因、操纵子、稳定的染色体片段，可移动因子如质粒、转座子、整合子和插入序列及“nuon”等。“nuon”指任何可作为基本选择单位的核酸，包括基因、基因融合、编码蛋白催化区的基因模组、基因间区、内含子、外显子、启动子、增强子、滑移区、终止子、伪基因、微卫星以及长和短的穿插元件等。

生物个体进化（organismal evolution）的选择单位通常是典型的微生物克隆，或携带特定基因组的细胞系，还包括同类或地方种群。

个体以上水平的进化（supra-organismal evolution）选择单位可以是一个微生物物种、进化分枝上单一群系和微生物物种的群体，还可以是与特定宿主相关的菌群。我们经常使用“系统”这一术语来描述高度复杂的个体结构。

在耐药的进化过程中，抗生素发挥了选择作用，或者说在这些层级水平造成了不均衡。系统中的各个部分相互作用会形成一些经常出现的复杂组合类型，这些类型多数是无益的，有些是有害的，偶尔在特定环境中会非常巧合地形成某种组合类型如耐药基因的一个特别组合、一个质粒和一组相关的细菌克隆，从而被选择出来。这个角度拓展了关于选择仅仅针对一些耐药细菌的经典知识，扩大了抗菌药物的选择范围。

二、耐药性进化的限制

（一）饱和性限制：“目光短浅的进化”

抗生素耐药性的进化具有潜在的瓶颈。随着耐药机制效率的逐步提高，每个增量的选择优势也将逐渐减弱，直到功能效率达到增数的饱和点，并导致宿主在适应度上微不足道的改善。这些变化通常在酶动力学上会显示出来（如β-内酰胺酶对一定的β-内酰胺类抗生素的水解作用）。当达到这个阶段时，氨基酸序列的随机变化常常是损害而不是促进酶的功能。譬如，如果被修饰的靶位在细菌细胞中有非常重要的功能，引起高水平耐药的突变有可能对细菌细胞是致死性的，这种进化可被认为是“目光短浅的进化”。

（二）抗生素耐药性的代价及减少进化的代价

耐药性表型的基因突变可能对细菌产生多种不适应性，这意味着获得耐药性使耐药细菌在环境中的适应能力和竞争力降低。但是在抗生素压力下，那些与之竞争的微生物可能并不能利用这一点，使得耐药性细菌有机会去补偿这种不适应性，从而可能完全消除产生耐药性的生物学代价。在一个特定的环境中，基因内或基因外的变化（包括恢复性突变、基因沉默或敲除）可能补偿基因变化的损失，但在另一环境下这一补偿可能会增加生物学成本。基因复制可能弥补基因突变引起的功能下降，这种补偿效应可能具有重要的进化结果。事实上染色体补偿性突变最终会增加细菌的适应性，与此同时，这些微生物可能在生命的最佳状况下“毫无代价”地失去耐药性。耐药基因经常位于大质粒内，但携带质粒通常可以降低细菌竞争的适应性。所以，在停用抗生素时，在细菌种群中质粒介导的抗生素耐药性可能无法持续。例如四环素外排泵可用于从细菌内排出有毒代谢产物，质粒中同时含有非功能性博来霉素耐药基因及转座子Tn5，可能给宿主菌带来生存和生长的优势。

在适应良好的生物中，包括获得耐药性的任何改变均具有生物学风险。因而细菌产生了在进化的同时尽可能减少变异的机制。减少遗传变异最基本的机制是氨基酸基因编码的简并性，这样核苷酸的变化不会引起氨基酸序列的变化；通过高保真转录过程、或使用高效的转录错误修复机制如增加同源性重组或子链缺口修复等机制也可减少变异；许多细菌还进化出了降低突变频率至平均水平以下（hypomutation）的有效机制。减少选择压力同时也降低了可进化性，适应良好的菌株被迫离开其正常环境时，所受压力达到最大。许多抗生素耐药性机制，包括药物的解毒作用或药物的排出机制，均可降低抗生素介导的压力，以减少变异和可进化性。

三、抗生素耐药的流行病学和进化

当竞争性菌群面对抗生素环境时，那些获得了抗生素耐受性的细菌就会被选择出来，显然，耐药性对存活菌株并不能添加新功能，这仅是补偿（平衡）了暴露于抗生素的菌群繁殖数量的减少。因此，抗生素选择的耐药微生物是典型的“适者生存”的表现，面对抗生素的压力耐药微生物是唯一“适者”。产生抗生素的微生物常会同时产生耐药机制，产生抗生素的目标可能就是为获取独居的环境，作为生产者同时因为自身耐受该抗生素而能够生存。因此，所有的环境资源可被抗生素产生菌株单独利用，从利用资源获得排他性来说，抗生素耐药是一种定居因素，排他性意味着“对其他的封闭”。在自然界中，抗生素已成为在微生物的环境中时常出现的成分，特别是在人类和动物体内的微生物环境中，微生物获得的耐药性不仅是一个保护机制，也是耐药菌群在抗生素环境中的一种排他因素。

（一）耐药株、流行株、地方株和异源同基因耐药株

耐药株（resistance）在频繁接触药物的环境中，抗生素耐药性可能有助于微生物的传播，成为流行株（epidemics）；超易变的微生物更适于宿主的定殖，成为地方株（endemics），完成宿主到宿主的传播，这些微生物也易于通过突变或与外源基因发生同源性重组而产生对抗生素的耐药性。另一方面，流行的致病性微生物在治疗过程中更频繁地暴露于抗生素，因此微生物的毒力、流行性和耐药性等趋于集中出现。抗生素耐药的克隆常常属于“优势克隆”，在获得耐药性之前就适合于定殖或传播，这种选择过程导致抗生素耐药决定子在不同的细菌种类之间传播（图6-3）。这些例子可见于耐β-内酰胺类抗生素的肺炎链球菌、粪肠球菌和金黄色葡萄球菌，或耐糖肽类抗生素的屎肠球菌。

分子技术的广泛应用，如使用限制性脉冲电场凝胶电泳（PFGE）来确定细菌克隆，对“流行”现象的分析提出了一个全新观点。在选定的医院里，当含ESBLs的肠道菌株发现了惊人的多样化克隆，如含blaCTX-M-10肺炎克雷伯菌株分属于13个不同的克隆。因此，此例是一个“blaCTX-M-10耐药菌株的流行”，但不属于经典的“流行”。这种现象称为异源同基因（allodemics）耐药株。从图6-3中去描述这种“allodemics”模式，异源同基因耐药株中聚集的是抗生素耐药，而不是病原微生物。换句话说，微生物的表型可以聚集，但微生物的遗传型不行。Allodemics的概念在自然选择中强调表型和遗传型之间不对称性的重要意义。Allodemic的状况表明，干预措施应更多聚焦产生耐药的环境因素，而不是单纯发现和消灭耐药菌株，譬如可降低相应抗生素的使用强度，以减少对产ESBLs细菌的选择作用。

（二）耐药性作为一种定植因子

耐药性不能“改善”细胞组成，只能补偿（平衡）由应用抗生素而减少的繁殖数量。尽管如此，抗生素耐药性在长期的细菌进化中仍能引发重要变化。自然选择能增加细菌对给定环境的生物利用能力，从而在竞争过程中获得了选择性优势。抗生素耐药性提供的这种选择优势不仅能补偿其生物学损失，而且获得一个新的利用栖息地的可能性。产生抗生素的微生物同时也产生了耐药的机制，并为自身换取了一个独有的空间，在这个环境中抗生素生产菌因为耐药才能生存。抗生素的释放将消除其竞争对手，某种程度上，耐药性细菌利用了人类生产和释放大量抗生素的生态学优势，耐药菌绝对数量的增加就是证明。

（三）抗生素耐药性的生物地理学和地方生物学

耐药性的生物地理学（biogeography of drug resistance）是研究在空间和时间上耐药性分布多样性的学科。在有高强度选择力的环境中（如在医院里，因为使用消毒剂和抗菌药物的习惯，发病机理和宿主之间的蔓延等），作为选择个体和单位的特异性亚种、克隆、质粒、转座子、整合子，或抗生素耐药性基因将逐渐被选择出来，并且个体和单位之间相互作用的可能性（易接近性-连通性）增加，会加速进化出有关耐药性的复杂结构。生态学和（或）系统发生学上比较疏远、密度较低及环境隔离的生物之间基因交换和进化的可能性较低。“基因交流群落（exchange community）”这一术语用以描述能交换基因的生物系统，基因交换偶尔会在种系发育关系较远却享有相似生活方式的生物之间进行，正如“生态封闭”的生物群倾向于保持相等的调节网络。“基因交换种群”必然是本地的种群；不同地方具有不同的抗生素使用历史，本地流行株/地方株携带着不同的进化组分。因此，新抗生素耐药性的产生和发展模式可能与生物地理学有关。当然“全球传播性克隆株”能播散若干参与抗生素耐药性的遗传元件，但一旦与当地生物接触，当地的生物系统将发生谱系地理学上的多样化变化。

（四）耐药性的作用：抗生素作为破坏生态系统的媒介

因为抗生素能引起多种细菌的功能障碍和死亡，所以这些药物能促进微生态系统的紊乱。这些药物的使用（特别是滥用）不仅引起细菌个体的瓦解，还会导致微生物多样性的丧失。当然，大自然能对生态失衡进行一定程度的恢复。但也应意识到抗生素的广泛使用可能会引发出现新的生物秩序，很难预测这些新秩序对整个系统是有益还是将导致新的自适应困难。

抗菌药物的释放如果超过临界值，就会影响微生物种群中的许多选择单位，扰乱微生物的种群。如在肠道菌群内或在某处土壤的微生物菌群内，在一个特定系统内细菌功能的丧失，可以被系统内残留的“剩余”菌群修复，也可被其他具有相似功能的菌株修复，或被来自相连系统输入的移居菌群修复，或被最终出现的新变种等修复。在微生物个体水平（单一细菌），过剩或简并的基因可以修复或克服抗生素带来的破坏。即通过导入外源性基因从而使抗生素无效，或通过突变或依赖重组而导致抗生素的耐药性。在多单位选择的假说中，这些药物可能对亚生物水平（suborganismal）上的质粒、整合子、操纵子、基因、插入序列和蛋白质等进化单位产生二级影响。在一所专门的医院里，抗生素对环境的扰乱可以选择不同类型的细菌克隆，并富集了这些克隆所携带的基因或蛋白质。在放大选择过程中，可能增加了某些克隆、遗传因子和其他分子之间的相互作用。进化单位的最佳组合在数量上的增加，有助于提高微生物的自适应能力，这反映了一种“基因资本主义”的现象。产生耐药性可能构成一个生态风险，灭活抗生素的能力又是一个生态保护因素。

（五）抗生素耐药性的进化的可预测性

从更广泛的角度来看，研究抗生素耐药性进化轨迹是围绕着人类的生存环境建设一个健康的微生态系统。抗生素耐药性的传统的科学知识告诉我们，耐药性的进化是以随机为基础的过程，因此耐药性的进化从本质上说是不可预测的。目前微生物科学告诉我们，微生物的变异和传染性疾病在引起重大人类问题之前是可能（而且应该）进行控制的。因为我们不能放弃防止病原微生物耐药株的出现和传播的可能性。预测抗生素耐药性的出现和传播仅仅是预测进化的一个练习，是需要遗传学量化研究的帮助，要涉及导致抗生素耐药的所有基因片段相互作用的分子系统发生学和流行病学研究，特别需要更好地选择量化考核，并考虑环境变化和相关的进化约束机制。

对新抗菌药物耐药性表型的进化并不局限于已知的耐药性酶，应该透彻分析新抗菌药物的化学结构，以便检测潜在的“酶的灭活作用点”。应用比较基因组学技术来推断基于共同的系统发育分布、保守基因邻域或基因融合的蛋白质之间功能的相关性。在建立的网络中使用得分方案（scoring-schemes）来考核模组间可能的关联性，包括抗生素耐药性的出现、表达、转移或进化。从模组化“基因组系统架构”（genome system architecture）的角度，可以在不同的微生物、质粒、转座子、整合子或蛋白质序列中发现诸如重组酶，通过不同方式组合的相同模组。事实上多重耐药性是遗传性进化组合的结果，如果有可能制作单元模组化功能的综合目录，那么这些模组在序列比对中的组合就有可能预测出细菌的适应能力。生物信息学（网络基因组学和蛋白质组学）使用从语言学和符号学中学习的原则，耐药性的进化以组合学、模糊逻辑模型的内涵去完成发现模组亲和力关系法则的任务。预测生物的进化轨迹，需要大量的研发工作，以便在特定环境及其相互的联系中去定义最有效的模组。

（杨淑凤　孙文长　夏梦岩　张卓然）