HCV ORF的长度在9024～9111nt之间，可编码长度约3000aa的前体多蛋白，其长度在不同基因型中有所不同。目前研究显示，HCV的ORF可编码至少11个蛋白，依据在病毒组装和复制过程中功能作用可基本分为结构蛋白和非结构蛋白（表1-1）。这11个蛋白包括3个结构蛋白：核心蛋白、E1和E2；7个非结构蛋白：NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B，以及小蛋白p7其功能目前尚未鉴定清楚；还有1个被称为“F”的蛋白，该蛋白为核心蛋白编码区移码翻译表达的产物，目前功能尚未完全阐明，因此暂列入结构蛋白基因区。

HCV核心蛋白（core protein）在病毒复制中的主要功能是组成病毒核衣壳，也是病毒RNA的结合蛋白，可包装病毒基因组RNA。核心蛋白的基因编码序列位于病毒前体多蛋白编码区的首位，其后为E1和E2包膜糖蛋白。在HCV基因组序列中位于342～914nt，该序列可编码长度为191个氨基酸的核心蛋白前体（P23），分子量约为23kD。研究已显示，HCV 核心蛋白存在多种不同的剪切加工形式，分子量分布可从17kD至23kD，其中分子量21kD的P21是核心蛋白最主要的存在形式。

HCV 核心蛋白可分为3个主要的区域。D1（Domain Ⅰ）区位于N端开始的约122个氨基酸的区域，该区带有大量的碱性氨基酸，具有很强的亲水性。该区域的功能被认为与基因组RNA的结合和介导病毒核衣壳的组装有关，并起到核定位信号的作用，研究显示在该区存在3个核定位信号（NLS）。同时该区域也参与了核心蛋白与许多宿主细胞蛋白的相互作用。D2（Domain Ⅱ）位于核心蛋白的C端，长度约为50个氨基酸，在亲疏水性质上与D1区正好相反，D2区疏水性强。D2区的功能与核心蛋白与宿主细胞的内质网（ER）、线粒体外膜和脂类小滴（lipid droplets）的相互作用有关。HCV 核心蛋白的该区域具有一定独特性，在黄病毒科的其他大部分成员的核心蛋白上未发现该区域。D3（Domain Ⅲ）区也称为信号肽区，位于前体核心蛋白C端D2区后的大约20aa长度的区域（aa 175～191），具有很强的疏水性，可形成典型的α螺旋，该区域功能是作为下游包膜蛋白E1的信号肽序列。在核心蛋白翻译出来后不久该区域便被切除，因而在成熟的核心蛋白上不存在该区域。但研究也显示，D3区在HCV 核心蛋白的稳定、定位和功能上似乎也具有很重要的作用。

HCV 核心蛋白的定位和功能与在前体多聚蛋白肽链上随后的病毒包膜糖蛋白E1/E2有很大不同，核心蛋白主要以可溶状态位于细胞质中，而包膜糖蛋白定位于宿主细胞膜系统上。在翻译过程中，D3区起到重要的作用，当核心蛋白翻译产生后，形成的多聚蛋白在疏水的D3区介导下定位于宿主细胞内质网（ER）上，定位于内质网上的一个信号肽酶精确地从D3区C端将多聚蛋白切开释放出不成熟的核心蛋白。另一个内质网酶，信号肽酶（SPP）接着在内质网的细胞质面将不成熟的核心蛋白上的D3区切除从而形成成熟的核心蛋白。研究显示，D3序列本身和核心蛋白上的三个疏水氨基酸Leu-139、Val-140和Leu-144 是SPP剪切所必需的。然而，产生成熟的核心蛋白（p21）的精确剪切位点目前还存在争议，Leu-179、Leu-182、Ser-173和Phe-177都曾被报道可能是剪切的位点。

HCV 核心蛋白在病毒复制中可组成核衣壳。通过透射电镜观察慢性丙型肝炎（CHC）患者的肝组织标本切片或血清样品，可观察到有包膜和无包膜的病毒颗粒，研究也显示有包膜包裹的和没有包膜的核心蛋白均可以双体或多聚体的形式存在。分析显示，有包膜的HCV病毒粒子的密度为1.08～1.16g/ml，而对于无包膜的HCV核衣壳的密度检测数据并不完全一致，有1.25g/ml或1.32～1.34g/ml。目前认为，成熟和不成熟形态的核心蛋白都可以组装成为病毒核衣壳，其中绝大多数为成熟的核心蛋白。由于目前仍缺乏一个理想的研究HCV病毒粒子组装的模型，关于HCV复制周期中晚期阶段的研究仍有许多问题尚待阐明。

研究显示在不同的表达系统中，表达的HCV 核心蛋白可组装成核衣壳样颗粒（nucleocapsid-like particle，NLP），这些表达系统包括大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞和无细胞表达体系。在含有复杂二级结构的RNA分子（如tRNA或者HCV 5′UTR区）存在的情况下，应用大肠杆菌表达系统表达纯化的截短的核心蛋白可组装形成与天然HCV类似的规则的颗粒结构，而全长的重组核心蛋白却组装形成不规则的颗粒结构。原核系统中的研究显示，D1区已可满足核心蛋白组装的需要，核心蛋白的N端75aa即可在大肠杆菌表达系统中进行NLP的组装，而且D2区的去除有利于核衣壳的组装，其纯化的重组蛋白可成形态更规则的颗粒结构。应用麦胚提取物或兔网状细胞裂解液构建的无细胞体系表达系统中，表达的全长核心蛋白可以成熟或非成熟的方式组装出HCV的核衣壳颗粒，其外形与结构均与患者体内分离的天然颗粒相似，并且其具有很高的组装效率。在昆虫细胞表达系统中，核心蛋白也可在昆虫细胞的内质网上组装形成直径约30～60nm的颗粒，这种组装形式与核心蛋白在体内的组装形式十分类似，但目前尚未获得能够在昆虫细胞进行高效分泌表达核心蛋白颗粒的表达方法。在酵母细胞表达系统中，表达的HCV核心蛋白也可组装形成NLP。然而在哺乳动物细胞表达系统中，目前通常认为现有的哺乳动物细胞系不能支持HCV核衣壳的组装，即使是在核心蛋白高水平表达的HCV复制子（replicon）细胞系中也未能发现HCV颗粒的组装，虽然也有少量的报道显示可以在体外组织培养的细胞系中表达获得NLP。这似乎表明，在哺乳动物细胞系中可能缺乏一些组装必要的细胞因子或者存在抑制因子，从而导致绝大多数的核心蛋白不能获得正确定位，或可能还存在其他一些负调控途径导致无法组装成为NLP。同时研究也显示，HCV核衣壳的组装效率并不与核心蛋白的表达水平成正相关，有报道显示核心蛋白表达水平降低200倍，而检测到的NLP的组装效率只降低了约2.3倍，HCV的这种组装效率的核心蛋白浓度非依赖性与其他不同类型病毒的核衣壳组装方式有很大不同。目前，对于HCV 核心蛋白的详细组装机制仍在进行进一步的深入研究。近年来，人原代肝细胞的3D培养技术获得了进步和发展，通过该系统可实现HCV的体外感染和复制，但其操作复杂性较大且复制效率也偏低。HCV JFH株的发现也促进了相关的研究，研究显示HCV JFH株可在体外细胞系中进行表达复制，将携带JFH株基因组序列的感染性克隆质粒转染入组织培养细胞可产生具有感染能力的HCV病毒粒子。这些研究为建立更为完善的HCV体外细胞感染模型和深入探讨病毒颗粒的组装机制提供了重要基础。

HCV 核心蛋白组装核衣壳的另一个重要功能是包装病毒基因组RNA。核心蛋白的D1区具有很强的亲水性，其碱性氨基酸上的正电荷基团可与核酸骨架上的带负电荷的磷酸基团相结合。研究显示，与HCV 核心蛋白结合的RNA分子需要包含有复杂的二级结构，重组表达的核心蛋白不能与变性后的或者缺乏二级结构的RNA分子组装形成核衣壳。目前，对于核心蛋白是否能够特异识别包装病毒基因组RNA尚存在不同的认识。Fan等人的研究显示，核心蛋白可特异识别5′UTR区标记了放射性探针的病毒RNA，不受其他对照RNA的影响。然而，Santolini 等的研究显示，HCV 核心蛋白与HCV基因组RNA和异源RNA分子的结合效率是相似的，并不存在明显的特异性。也有研究提出，在核心蛋白进行组装的微环境中可能只存在一种类型的RNA分子即HCV基因组RNA分子，这样核心蛋白只能包装病毒基因组RNA。目前，对于HCV 核心蛋白如何选择病毒基因组RNA分子的机制仍有待进一步的研究。

HCV 核心蛋白除了在病毒核衣壳组装中扮演关键角色，还被发现可与宿主细胞内的许多蛋白存在相互作用并参与调节许多宿主细胞信号传导通路。核心蛋白被发现可存在于在被病毒感染的细胞内和CHC患者的血清中。HCV 核心蛋白具有促进和抗细胞凋亡的功能。有研究显示，核心蛋白可通过在转录水平上调生长相关基因从而刺激肝细胞株Huh-7的增殖，同时也被发现与组织损伤和纤维化进程有关。HCV 核心蛋白也能够调节宿主细胞内一些基因如c-myc、c-fos、IL-2基因的活性，以及能够改变其他病毒启动子如SV40早期启动子、RSV LTR的转录活性。

HCV 核心蛋白在HCV慢性感染的建立中具有重要作用。研究显示，核心蛋白可作为一种免疫调控分子通过与T细胞上的补体受体（gC1qR）的相互作用从而抑制T淋巴细胞的免疫应答，同时这种结合还导致了CD4+ T淋巴细胞中的负调控信号分子SHP-1和SOCS1的表达，从而抑制宿主的抗病毒免疫反应。HCV 核心蛋白也可与细胞Toll样受体（TLR）存在作用，影响宿主的天然免疫反应。HCV 核心蛋白能够激活宿主细胞的干扰素（interferon，IFN）系统，核心蛋白能够激活两种主要的调控IFN抗病毒反应的IFN激活基因2-5 OAS和PKR的表达。HCV 核心蛋白能够诱导细胞IFN调控因子-1（IRF-1）的转录和表达，从而诱导IFN-β的表达。在IFN-α存在的情况下，核心蛋白表达能够增强IFN激活基因因子-3（ISGF3）与IFN激活响应元件（ISRE）和酪氨酸磷酸化的Stat1的结合。核心蛋白可增强宿主细胞的NF-κB信号通路，该通路是机体免疫与炎症反应的重要激活途径，核心蛋白可通过该途径影响宿主细胞的免疫和炎症反应水平。核心蛋白也能激活细胞的IFN-γ信号通路。HCV 核心蛋白对TLR和IFN作用的影响对于建立HCV慢性感染是十分重要的。当HCV感染后核心蛋白激活起细胞强烈的TLR、IFN防御反应后将不利于HCV建立慢性感染，而当核心蛋白只能非常微弱地激活TLR或IFN系统的反应时可能有利于病毒建立慢性感染状态。研究显示，在临床CHC患者中核心蛋白存在准种（quasispecies），不同序列特征的核心蛋白或不同基因型的核心蛋白激活IFN启动子的效率存在差异，表明了核心蛋白变异的HCV准种在调控宿主细胞抗病毒反应的能力上存在差异。这提示了HCV准种研究的重要性。

HCV 核心蛋白在丙型肝炎发病机制中也具有重要作用，在致肝细胞癌（HCC）过程中起到了重要作用。体外研究显示，核心蛋白可与载脂蛋白A2（apolipoprotein A2）进行直接的相互作用而诱导细胞内的脂质小体（lipid droplets）形成，因此被认为可能在肝脏的脂肪变性（steatosis）中起到直接的作用。HCV 核心蛋白基因转基因小鼠中可产生脂肪变性和导致HCC。但目前对于在体内HCV 核心蛋白诱导脂肪变性的具体机制仍不十分清楚，可能是由于核心蛋白与肝细胞内与脂肪积累相关的蛋白存在相互作用而导致了细胞脂肪代谢机制的改变。然而需要注意的是，并不是所有的转基因小鼠都能够产生脂肪变性和HCC现象，这说明核心蛋白可能并不是导致上述现象的唯一因素，病毒的基因型、序列变异、蛋白表达水平差异和所使用的小鼠的遗传背景都可能会对实验结果产生影响。显然，这些机制还需要通过更为完善的动物模型和全面的实验数据进行分析阐明。

E1和E2蛋白是HCV的两个包膜糖蛋白，是HCV包膜的主要组成部分。E1和E2对于病毒与宿主细胞的结合和感染过程是必需的。E1的分子量为33～35kDa，E2的分子量为70～72kDa，可通过非共价键组成E1/E2异二聚体。E1和E2蛋白都属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，N端膜外区分别有160aa和334aa，C端均有一个短的穿膜区，长度为30aa。E1和E2蛋白的膜外区包括有许多脯氨酸（proline）和半胱氨酸（cysteine）残基，但目前尚未观察到E1和E2蛋白存在分子内的二硫键。

E1和E2蛋白都是高度糖基化的蛋白，分别包括多达5和11个糖基化修饰位点。分析显示，E1蛋白的5个糖基化位点在HCV各基因型中基本都是高度保守的，而其中位于250aa的糖基化位点的保守性差一些，仅在基因1b型和基因6型中存在。E2蛋白的糖基化位点的保守性也较好，11个糖基化位点中有9个在各基因型中是高度保守的，保守性较差的N5和N9糖基化位点的保守性分别为75%和89%。糖基化位点的突变可能会改变来自CHC患者的多抗血清与病毒包膜蛋白的反应，并影响包膜蛋白的功能。E2蛋白上的N2和N4糖基化位点对于保持HCV进入宿主细胞的能力是必需的，糖基化位点的突变不会明显改变HCV包膜糖蛋白肽链的折叠以及病毒颗粒组装，但会使形成的子代病毒的感染能力显著降低或丧失。

E1和E2蛋白的穿膜区与E1和E2蛋白在细胞膜上的锚定、内质网上的定位和异二聚体的组装等密切相关。E1和E2的穿膜区由两段疏水的氨基酸组成，中间由一段短的至少包含有1个高度保守的正电荷氨基酸残基组成的极性区间隔。研究显示，删除穿膜区的E1和E2蛋白可获得分泌表达。穿膜区的第二段疏水氨基酸序列具有信号肽的功能，这与HCV的E1和E2蛋白从前体多蛋白上通过宿主细胞的信号肽酶剪切下来密切相关。然而值得注意的是，位于E1和E2穿膜区的该段疏水氨基酸序列与位于未成熟的HCV 核心蛋白C端的信号肽序列不同，其不会与细胞的信号识别颗粒（signal recognition particle，SRP）发生相互作用，因此并不是真正意义上的信号肽，应被称为转位再起始信号（signals of reinitiation of translocation）。在体外表达系统中，删除了这些信号序列的E1或E2蛋白可获得分泌表达，表明这些信号序列参与了E1和E2蛋白的膜定位。E1和E2蛋白的内质网定位信号也位于穿膜区中，位于穿膜区的两段疏水氨基酸序列中间的正电荷氨基酸残基在E1和E2蛋白的内质网定位中起到了关键作用。E1和E2的穿膜区在E1/E2蛋白异二聚体形成中也起到重要作用。删除或替代E2蛋白的穿膜区将无法形成E1/ E2蛋白异二聚体。

目前，对HCV E1蛋白的功能了解较为有限，认为其应参与了病毒在宿主细胞质内与细胞膜系统的融合作用。而HCV E2蛋白在HCV感染早期起到关键性的作用。E2蛋白包含有高变区（hypervariable region，HVR），其氨基酸序列在不同的HCV基因型间和同基因型的不同亚型间的差异可以达到80%。高变区HVR1长度为22aa，该区域被认为是最主要的HCV中和抗体表位区。尽管HVR1区序列变异巨大，然而在所有已知的HCV基因型中HVR1区的氨基酸残基的理化性质和整体空间构象却是高度保守的，这说明该区域在病毒生活史中具有重要的作用。当然，目前已发现在HVR1外也存在HCV的中和抗体表位。HCV对宿主细胞的附着首先是通过E2蛋白与细胞表面的受体复合物相互作用引发的。由于HVR1区在序列的特定位置上具有正电荷残基，因此可与细胞膜表面的负电荷分子产生相互作用，这种相互作用在HCV对宿主细胞的识别附着，在感染细胞或组织选择上是比较重要的。目前已经发现的可能的HCV细胞受体有氢乙罂粟碱（tetraspanin，CD81）、清道夫受体-BI（scavenger receptor class B type I，SR-BI）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）受体、C型凝集素受体（DC-SIGN）和黏附分子受体（L-SIGN，CD209L）、唾液酸糖蛋白（asialoglycoprotein）受体等，其中CD81和SR-BI是目前发现在不同基因型HCV感染中均起到重要作用的细胞受体，靶向CD81和SR-BI的抗体或者siRNA都能够降低假型HCV对靶细胞的感染能力。但并非所有可共表达CD81和SR-BI分子的细胞系均可支持HCV的感染，只有人肝来源的细胞系才能表现出支持病毒感染的能力。此外，也有研究发现在体外HCV假病毒感染细胞模型中，人血清可促进HCV假病毒感染Huh7细胞，这种增强作用甚至可以掩盖血清中的HCV中和抗体对病毒感染的阻断作用，研究显示这种增强作用是由血清中的高密度脂蛋白（HDL）与HVR1以及B族Ⅰ型清道夫受体（SR-BI）的相互作用介导的。目前，对HCV包膜蛋白与细胞受体间的相互作用以及感染机制还有待更为全面深入的研究。

HCV F蛋白是近年在HCV慢性感染患者血清中发现的一种HCV编码蛋白。F蛋白也称为核糖体读码框移位替代蛋白（alternate ribosomal frameshift protein，ARFP），是在HCV前体多聚蛋白的core编码区N端翻译中核糖体读码框移码-2/+1nt产生的。研究显示，核糖体在核心蛋白编码区上存在多种读码框移位位点，HCV基因型1a的读码框移位可发生在N端起始后的第8～11位氨基酸密码子，编码162aa残基的F蛋白；基因型1b的读码框移位发生在N端起始后的第42位氨基酸密码子，编码144aa残基的F蛋白；基因型2a编码的F蛋白长度为126aa残基。并且可能还存在其他不同的读码框移码方式，其移码位置与F蛋白的编码长度可能与HCV基因型有关。研究也显示，F蛋白的核糖体读码框移码翻译并不依赖于HCV 的IRES。目前，对F蛋白的核糖体读码框移码翻译的具体机制的认识仍较少。

研究显示，在HCV慢性感染患者血清中可检测到与F蛋白多肽反应的抗体。尽管不同基因型HCV 的F蛋白的长度与氨基酸序列存在差异，然而不同毒株来源的重组F蛋白的多抗血清存在较强的交叉反应性。对F蛋白在宿主细胞中的定位研究显示F蛋白可定位于胞质的内质网上，因此推测F蛋白可能在HCV的复制过程中具有一定作用，但尚未证实F蛋白与其他HCV蛋白存在相互作用。在多数情况下，F蛋白在HCV感染细胞中检测到的表达水平很低。并且在体外HCV复制子（replicon）细胞模型的研究结果显示，缺少F蛋白并不会影响HCV基因组的复制。目前已发现，在HCV肝癌患者体内分离到可在体外高水平表达F蛋白的毒株，且F蛋白的表达水平与患者肝脏的组织学损害程度相关，因此也有推测认为F蛋白的表达水平与HCV致病性相关。有研究也显示，F蛋白可抑制细胞周期调控蛋白p21的表达，但未表现出致细胞转化的作用。F蛋白不能抑制TNF-α介导的细胞凋亡。目前，对于F蛋白的详细的翻译表达调控机制以及其在HCV感染过程中的作用尚未完全了解，还需要开展更为深入的研究。

HCV p7蛋白的编码位置位于结构蛋白E2与非结构蛋白NS2之间，其肽链长度为63aa。P7蛋白定位于细胞内质网膜，具有2个α螺旋跨膜结构域，是一种双跨膜结构，之间有一个位于细胞质端的亲水的环连接结构。目前认为，p7蛋白属于病毒孔道蛋白（viroporin）家族。P7蛋白可在宿主细胞的内质网膜中形成同源6聚体阳离子通道，该通道对钙离子具有优先通过能力，因此也被认为具有钙离子通道功能，同时，该离子通道可能在HCV病毒颗粒的装配与释放中具有重要作用。P7蛋白的亲水环状连接结构的保守氨基酸对于p7蛋白的离子通道功能具有关键作用。在HCV动物模型黑猩猩体内进行的研究结果显示，p7蛋白胞质连接环区保守氨基酸突变或敲除的HCV丧失了体内感染能力。而在体外HCV replicon复制子细胞模型研究中获得的数据则显示，p7蛋白对于病毒RNA的复制不是必需的，p7蛋白缺陷不会影响亚基因组RNA的在细胞中的复制。这说明，p7蛋白在HCV对宿主细胞的感染中具有重要作用，是HCV感染所必需的病毒蛋白。P7蛋白形成阳离子通道，因此，p7蛋白可作为抗HCV药物研究中的一个重要靶点。研究已显示，金刚烷和具有长烷基侧链的亚氨基糖衍生物DNJ、DGJ具有抑制p7蛋白的阳离子通道功能，是有效的HCV感染抑制剂。目前，对于p7蛋白的功能及其作用机制的认识仍较为有限，还需要进行更多的研究。

HCV NS2蛋白是一种非糖基化的跨膜蛋白，分子量为21～23kD。NS2（810～1026aa）与NS3蛋白的N端（1027～1206aa）共同组成HCV NS2/3蛋白酶，其是一种锌原子依赖的金属蛋白酶（图1-3），其功能是在1026位氨基酸的位置主要以分子内剪切的方式将NS2和NS3蛋白剪切开。目前认为，NS2蛋白主要定位于细胞内质网膜上。

NS2蛋白的N端有一段高度疏水的区域，包含有多个跨膜结构，目前认为该区域对于NS2/3蛋白的剪切活性不是必需的。NS2蛋白疏水区域后的907～1026aa肽段与NS3蛋白N端的1027～1206aa肽段共同构成NS2/3蛋白酶活性的关键区域。NS2/3蛋白酶并不具有目前常见的蛋白酶的经典序列特征，氨基酸序列比对分析显示其与GBV和牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）的NS2/3蛋白存在较高相似性。NS2蛋白中的H952、E972和C993这三个氨基酸对于NS2/3蛋白酶活性是十分重要的，在所有的HCV基因型中是高度保守的。研究显示将H952或C993突变为丙氨酸可导致NS2/3蛋白酶彻底失活，将E972突变为谷氨酰胺也会显著降低NS2/3蛋白酶的活性。NS2/3蛋白酶剪切位点及周边氨基酸序列在不同基因型的HCV毒株中也是高度保守的。虽然NS2/3蛋白酶活性区段主要位于NS2段，但研究发现，完整的NS3蛋白肽链对于保持NS2/3蛋白酶的活性也是重要的。NS3肽段上1123、1127、1171位的半胱氨酸和1175位的组氨酸是NS3锌指结构锌原子作用位点，上述位置氨基酸突变不但可导致NS3蛋白酶活性丧失，还可导致NS2/3蛋白酶活性的丧失，这说明完整的NS3肽段对于保持NS2/3蛋白酶活的重要性。NS2/3蛋白的剪切主要是一种分子内的自剪切，但也有研究发现，在一些细胞转染实验中可观察到少量的分子间剪切的现象。在体外系统表达的重组NS2/3蛋白可形成二聚体也说明了是存在产生分子间剪切现象的基础，并且这种二聚体形式很可能是NS2/3蛋白酶剪切作用所必需的，目前，对于这方面的认识还不够清晰全面，还需要进一步加强研究。

目前对于NS2/3蛋白酶在HCV感染与复制周期中的作用有不同的认识。在HCV感染动物模型黑猩猩体内研究的结果显示，NS2/3蛋白酶活性对于HCV在体内建立起持续感染是必不可少的。然而，体外HCV replicon模型进行的研究显示，缺乏NS2蛋白编码序列的HCV亚基因组复制子依然能够在细胞中进行有效的复制，这说明对于病毒基因组的复制而言NS2/3蛋白酶活性可能不是必需的。此外，目前对于NS2/3蛋白酶在HCV感染周期中的作用还有一些推测，其是否与BVDV的NS2/3蛋白类似在病毒复制与致病进程中起到调节的作用。由于目前对于NS2/3蛋白酶的生物学作用的认识还不够全面，还需要进行更深入的研究。

NS2蛋白在从NS2/3肽链上剪切出来后就失去了蛋白酶活性，但研究显示，剪切后的NS2蛋白与HCV其他蛋白和多种宿主细胞存在相互作用。体外的细胞内共定位和免疫共沉淀检测实验显示，NS2蛋白与其他的HCV非结构蛋白存在相互作用，这说明NS2蛋白可能在病毒复制或进程调控中起到某些作用，但目前还没有更多的相关证据。NS2蛋白可与多种宿主细胞蛋白存在相互作用，通过影响转录和翻译的多个途径调控宿主细胞蛋白的表达。研究显示，NS2蛋白在几种不同的肝来源细胞和非肝来源细胞中对多种不同启动子的转录活性具有抑制作用，这些启动子包括人亚铁螯合酶（human ferrochelatase）启动子、核转录核因子结合位点、SV40启动子、肿瘤坏死因子α（TNF-α）启动子、巨细胞病毒（cytomegalovirus）极早期启动子。NS2蛋白N端的810～940aa的肽段即可引发这种抑制作为，因此认为这种抑制作用应该不需要NS2/3蛋白酶的参与。但目前这些相互作用对HCV感染与复制的影响尚未研究清楚。NS2蛋白参与了病毒对宿主细胞凋亡途径的抑制作用。有研究显示，NS2蛋白能够抑制线粒体上的促细胞凋亡因子CIDE-B（cell death-inducing DFF45-like effector）介导的细胞凋亡，NS2可通过与CIDE-B的C端进行特异结合阻止CIDE-B的二聚体化，从而抑制细胞色素C从线粒体中的释放，阻断细胞凋亡进程。

HCV NS3蛋白在HCV感染与复制中扮演了多种重要的角色，NS3蛋白的肽链长度为631aa，可主要分为两个活性结构域：位于N端方向约1/3部分肽段的丝氨酸蛋白酶活性域和C端方向约2/3部分肽段的解旋酶活性域。HCV NS3蛋白可与NS4A蛋白以异二聚体非共价键结合的方式构成NS3-NS4A丝氨酸蛋白酶，其是HCV前体多聚蛋白剪切加工的关键蛋白酶，其剪切产物包括了NS4A、NS4B、NS5A、NS5B蛋白。NS4A在NS3-NS4A蛋白酶中作为NS3蛋白酶活性的辅助因子，NS3-4A蛋白酶可在非离子型去垢剂环境中稳定存在，研究显示，阻断NS3与NS4A蛋白的相互作用可导致蛋白酶活性的显著降低或者丧失。NS3-4A蛋白可通过与宿主细胞蛋白和信号传导通路的相互作用在HCV感染和致病机制中起到重要的作用。

NS3-NS4A蛋白酶在HCV生活史中起到必不可少的作用，其主要作用是催化HCV前体多聚蛋白的剪切，其剪切位置分别在NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A和NS5A/NS5B的连接处。在体外细胞模型实验和体内黑猩猩动物模型实验结果均显示，NS3-NS4A蛋白酶对于HCV复制是必不可少的。

目前的研究已经获得了NS3丝氨酸蛋白酶与NS4A复合物的3维晶体结构。分析显示，NS3蛋白的57位组氨酸、81位天冬氨酸和139位丝氨酸是关键酶活中心，共同组成了丝氨酸蛋白酶家族典型的催化三联体。对这些氨基酸位点进行突变或替换操作都会导致NS3-NS4A蛋白酶剪切活性的丧失。NS3蛋白N端的丝氨酸蛋白酶活性可不依赖于C端的解旋酶活性域，研究显示在C端解旋酶肽段缺失的情况下N端的丝氨酸蛋白酶活性域肽段依然能够保持剪切活性。目前认为，NS3蛋白N端长度约180aa的肽段是丝氨酸蛋白酶活性域的基本区段，分析对该区段进行的逐点截短对酶活的影响显示，C端截短会导致酶活丧失，N端截短至22位氨基酸会显著影响酶活性。NS3-NS4A蛋白酶具有一个锌原子结合结构，目前认为NS3肽链上的97位、99位、145位半胱氨酸与149位组氨酸构成了与锌原子结合的结构域，锌原子在NS3-NS4A蛋白酶的空间构象稳定和结构域正确折叠中具有重要作用。

目前，对NS3-NS4A蛋白酶的剪切位点已有一定的认识，剪切位点区域的氨基酸长度应至少为10个氨基酸，及剪切位点N端方向为6个氨基酸和C端方向的4个氨基酸，从N端或C端进一步减少酶切位点区域肽段的长度会导致剪切效率的显著降低。对不同HCV分离株的氨基酸序列分析显示这些剪切位点具有一些普遍的特征，在剪切位点N端方向的第1个氨基酸通常是带有巯基基团的氨基酸（如苏氨酸或半胱氨酸），剪切位点C端方向的第1个氨基酸通常是具有小侧链结构的氨基酸（如丙氨酸或丝氨酸），剪切位点N端方向的第6位氨基酸通常是酸性的氨基酸（如谷氨酸或天冬氨酸）。NS3-NS4A蛋白酶的剪切位点间应该不具有相互的影响，对位于NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A和NS5A/NS5B的剪切位点分别进行点突变，单一剪切位点的破坏不会对其他剪切位点产生影响。

NS4A蛋白是NS3-NS4A蛋白酶的重要辅助因子，其肽链长度为54aa，可与NS3蛋白以非共价键形成异二聚体的结构形式。缺乏NS4A蛋白，NS3丝氨酸蛋白酶只能剪切NS5A/NS5B位点，对NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/ NS5A位点的剪切效率显著降低。研究显示，NS4A蛋白的中间区域肽段（21～34aa）是NS3丝氨酸蛋白酶活性的辅助区域，其中25位和29位异亮氨酸对该区域的功能具有关键作用，该区域可与NS3蛋白的N端开始的22个氨基酸长度的肽段对应进行非共价键结合作用，破坏这种相互作用会导致NS3丝氨酸蛋白酶活性的显著降低或者丧失。

HCV NS3-NS4A蛋白酶除了具有剪切HCV前体多聚蛋白的功能，同时也与多种宿主细胞蛋白具有相互作用，在干扰宿主细胞的抗病毒反应中具有重要作用，可有助于HCV在感染早期阶段避免先天免疫反应的影响。研究显示，NS3- NS4A蛋白酶可阻断toll样受体3（TLR-3）依赖和非TLR-3依赖的信号转导通路的激活。TLR-3信号通路下游的干扰素调控因子3（IRF-3）是病毒感染引发干扰素反应的重要调控因子，NS3-NS4A蛋白酶通过降解TLR-3信号通路的关键因子TRIF抑制TLR-3信号通路，进而抑制下游IRF-3的磷酸化激活，抑制细胞抗病毒IFN反应。NS3-NS4A蛋白酶也可剪切细胞内的dsRNA敏感蛋白RIG-1的重要相互作用因子Cardif，进而抑制RIG-1与病毒dsRNA结合而引发非TLR-3依赖的IFN反应。研究也显示，NS3蛋白与致肝细胞癌有关，在体外NS3蛋白可诱导NIH 3T3细胞的转化，可抑制放线菌素D诱导的细胞凋亡作用，但目前NS3蛋白致细胞转化的具体作用机制尚未完全阐明。

由于NS3-4A蛋白酶活性在HCV复制中具有重要作用，因此也是抗病毒治疗研究中很合适的靶标。目前，NS3-4A丝氨酸蛋白酶结构域的X衍射晶体结构已得到解析，对于开发新型的抗NS3-4A蛋白酶的药物提供了重要基础。如BILN-2061、VX-950、SCH503034等，均是近年来发现的高效的NS3-4A丝氨酸蛋白酶抑制剂，临床研究显示，服用BILN-2061、VX-950、SCH503034治疗后的HCV患者体内的病毒载量可获得明显的降低，显示了良好的应用潜力。目前，这些药物均在进行临床试验，部分已投入临床应用。

NS3蛋白的解旋酶与NTP酶活性结构域由NS3肽链C端的442aa组成。NS3蛋白解旋酶结构域属于解旋酶超家族2（SF2）。NS3解旋酶-NTP酶具有多个功能，包括RNA激活的NTP水解酶活性、RNA结合和利用NTP水解释放的能量解开RNA的二级结构。目前已获得了该活性结构域的三维晶体结构。研究显示，在RNA复制中，NS3解旋酶是通过水解NTP所释放的能量来改变自身构象，使其具有不同的核酸结合构象，可在核酸中进行重新定位，从而使解旋酶可沿着核酸进行定向运动。研究显示，NS3蛋白与NS5B蛋白存在相互作用，其解旋酶结构可辅助NS5B的RdRp功能。此外，NS3解旋酶的活性也受到NS3蛋白酶结构域和NS5B RdRp的调控。NS3解旋酶与NTP酶在HCV复制中也具有重要作用，因此，NS3解旋酶与NTP酶也是抗HCV药物研究的重要靶点，小分子核苷类似物抑制剂QU663是近年发现的可针对NS3解旋酶的竞争性抑制剂，具有较好的抑制HCV复制的能力，目前仍在进行相关研究。目前，对于NS3解旋酶与NTP水解酶的认识仍有限，还需要进行更多的研究。

HCV NS4B蛋白是一种主要定位于细胞内质网的膜蛋白，其肽链由261aa组成，分子量约为27kD。蛋白三级结构预测数据显示NS4B可能含有4～6个跨膜区（TMD），在N端有一个两性α螺旋（amphipathic helix，AH）结构，TMD结构的敲除不会影响NS4B蛋白与内质网膜的结合，N端的AH结构则是NS4B蛋白与内质网的结合所必需的，其在不同基因型HCV中都普遍存在，被认为在NS4B蛋白与HCV复制复合物及膜支持系统的相互作用中起到较为关键的作用。在NS4B蛋白中还存在一个核酸结合域（nucleotide binding motif，NBM），该结合域的序列在各HCV基因型中都是高度保守的，对于HCV病毒复制是必需的。目前，对于NS4B蛋白的精确结构和定位机制仍未完全阐明，还需要进行更多的研究。NS4B蛋白在HCV的感染、复制和致病中具有多种重要的作用。

NS4B蛋白作为HCV复制复合物中的膜锚定蛋白，可通过诱导宿主细胞内质网膜结构的改变，形成有利于HCV基因组复制的膜系统环境，有研究称为膜网络（membranous web），可为病毒基因组RNA复制提供结构支架和保护，单独表达NS4B蛋白就可以引发细胞的这种膜网络的形成。目前认为，HCV复制需要由包括多种HCV非结构蛋白与RNA组成复制复合物，该复合物与由细胞内膜系统形成的脂筏（lipid raft）结构相联。脂筏是细胞内膜上的一种富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域（microdomain），其具有较为致密的结构特征，在4℃低温下可抵抗非离子型去垢剂的破坏作用。脂筏是细胞内许多重要蛋白作用的平台，与细胞内的信号转导和蛋白质加工等有密切的关系。NS4B蛋白与细胞脂筏存在相互作用，在单独表达各个HCV非结构蛋白的情况下，只有NS4B蛋白能够与脂筏相互作用，因此认为，NS4B在介导HCV其他非结构蛋白在脂筏上的定位起到了关键作用。内质网（ER）具有细胞内重要的膜系统也是重要的蛋白表达加工场所，NS4B蛋白在形成支持病毒复制复合物及其支持环境的过程中需要对细胞内质网进行调控。体外细胞模型实验显示，HCV replicon复制子可诱导内质网应激反应。NS4B蛋白在内质网应激反应（ER stress）及其调控中可能扮演了重要作用，通过与内质网应激反应的调控因子如CREB-RP/ATF6等的相互作用影响内质网应激反应。目前，对更为详细的反应机制的认识还有限，还需更深入的研究予以阐明。

HCV NS4B蛋白是机体体液免疫和细胞免疫的重要靶标。NS4B蛋白具有较好的抗原性，可以诱导较强的免疫反应，因此在最初应用NANB肝炎患者血清筛选cDNA文库克隆获得的首个HCV基因组序列中，即含有NS4B蛋白的编码序列。同时NS4B也是第一代HCV抗体诊断试剂所使用的重组抗原。同时，NS4B蛋白在抗HCV免疫治疗研究中也具有良好的应用潜力，NS4B来源的多肽可诱导产生抗病毒的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。研究显示，NS4B具有较强的免疫原性很大程度上与NS4B蛋白可对细胞的多个免疫反应调控途径产生影响。NS4B蛋白表达与HCV 核心蛋白一样可增强NF-κB信号通路，该信号通路是机体免疫与炎症反应的重要激活途径，NS4B蛋白和核心蛋白可通过该途径影响宿主细胞的免疫和炎症反应水平，可能也是HCV感染后宿主细胞白细胞介素-8（IL-8）表达水平增强的原因，因为IL-8启动子具有一个NF-κB的结合位点。目前，干扰素（IFN）是在HCV治疗中重要的治疗药物，然而HCV常出现耐受IFN治疗的情况。在体外HCV replicon细胞模型上对这种IFN治疗耐受机制的研究发现，NS4B蛋白的一个氨基酸替换（Q1737H）可能与HCV的IFN耐受有关。但目前这一因素是否就是IFN耐受机制的关键因素，还需要进行更多的研究。有研究显示，用环孢素A（cyclosporin A）消除细胞中的HCV复制子后，细胞仍然表现出对IFN的耐受，这提示在IFN耐受机制中可能还有宿主细胞的某些因子参与了作用。NS4B蛋白参与调控HCV NS5B蛋白的RdRp活性，体外研究显示NS3蛋白的解旋酶活性可以增强NS5B的功能，而NS4B蛋白这对着这种增强起到拮抗调节的作用。NS4B蛋白可影响宿主细胞和HCV蛋白的表达，在体外应用报告基因系统的研究显示，NS4B蛋白与NS4A蛋白的表达能够抑制HCV IRES启动的报告基因表达，这显示了NS4B蛋白可能是一种HCV自身的蛋白表达负调控因子。研究还显示，NS4B蛋白与核心蛋白、NS3蛋白、NS5A蛋白相似可能与HCV的致癌作用有关，NS4B蛋白表达可下调细胞周期调控蛋白p21/Waf1蛋白的表达水平，导致细胞增殖能力增强，表现出细胞转化的特征。在体外实验中，NS4B蛋白与Ha-Ras表达质粒共转染NIH 3T3细胞后可导致NIH3T3细胞失去接触抑制，表现出明显的细胞转化特征。

NS5A蛋白肽链长度为447aa，分子量为56～58kD，具有多个磷酸化位点，具有多种磷酸化形式。NS5A蛋白肽链富含脯氨酸，亲水性强，不具有明显的疏水跨膜结构形式。NS5A蛋白在宿主细胞中主要定位于细胞质或细胞核周边的细胞器中，如内质网、高尔基体等。NS5A蛋白在HCV复制中具有重要作用，是复制复合物的重要组分，同时NS5A蛋白可参与调控多种细胞信号通路，可调控宿主细胞的IFN反应，以及影响细胞生长与增殖。

由于尚未获得完整NS5A蛋白的结构生物学数据，目前，通过生物信息学方法分析将NS5A分为3个结构域，分别为结构域Ⅰ（1～213aa）、结构域Ⅱ（250～342aa）和结构域Ⅲ（356～447aa）。NS5A蛋白的结构域Ⅰ包含有一个两性α螺旋（AH）结构（5～25aa），这个结构在HCV中是高度保守的。AH结构对于NS5A蛋白的定位具有重要作用，其疏水面与NS5A蛋白在膜上的定位有关。AH结构同时也在HCV复制中具有重要作用，通过序列突变改变AH结构会显著抑制HCV的复制。目前认为，AH结构可为HCV复制提供重要的蛋白相互作用的平台。结构域Ⅰ中还具有一个由4个半胱氨酸残基（C39、C57、C59、C80）构成的锌原子结合基序。该结构对于维持NS5A蛋白的结构与功能具有关键作用，其任何一个半胱氨酸的突变都会导致NS5A蛋白结合锌原子能力的丧失并抑制HCV基因组RNA复制。NS5A蛋白除了在N端带有膜定位信号，其C端的354～362aa带有一个核定位信号（NLS），表明NS5A蛋白也具有核定位能力。研究显示，去除了N端序列的截短型NS5A蛋白可定位于细胞核中。然而，在N端序列存在的情况下NS5A蛋白C端的NLS功能并不能发挥作用，显示了NS5A蛋白将优先定位于核外质膜。NS5A蛋白的C端部分主要为正电荷区域，有大量的酸性氨基酸，是脯氨酸的富集区，具有较为典型的细胞调控因子的结构特征。目前已发现在细胞中存在可定位于细胞核的N端剪切的NS5A蛋白形式，这种剪切作用可能是由HCV感染导致的细胞凋亡过程诱导产生的，凋亡相关的caspase样蛋白酶可能参与了剪切过程，caspase活性抑制剂Z-VAD-FMK可抑制这种剪切作用。目前对于NS5A蛋白的剪切机制及其功能的认识仍有效，还需要进行深入研究。

NS5A具有多个磷酸化位点，具有多种磷酸化形式，其中基础磷酸化水平的NS5A蛋白分子量为56kDa，超磷酸化的NS5A蛋白分子量为58kDa。目前认为，NS5A蛋白的磷酸化位点主要位于肽链上的丝氨酸残基，少量位于苏氨酸残基。其中，肽链上222、225、229、232位的丝氨酸残基与NS5A蛋白的超磷酸化有关，肽链的228～278aa区域和378～447aa区域与NS5A蛋白的基础磷酸化有关，此外，349位的丝氨酸也与NS5A蛋白的基础磷酸化有关。NS5A蛋白的磷酸化位点在HCV中是较为保守的。然而也有研究发现，HCV基因型2a的NS5A蛋白不具有超磷酸化的形式。对于细胞内参与NS5A蛋白磷酸化加工的激酶（kinase），目前认为p70S6K、AKT、MEK1、MKK6等激酶参与了NS5A蛋白的磷酸化过程，该过程可能会受到细胞环境的影响。研究也发现，HCV的多种非结构蛋白如NS3-4A、NS2等与NS5A蛋白的磷酸化加工存在关联。NS3-4A蛋白酶活性和NS2-3蛋白酶活性对于NS5A蛋白的超磷酸化加工都是十分重要的，破坏这些蛋白酶的活性会使NS5A蛋白的超磷酸化水平显著降低或丧失。可以认为，NS5A蛋白的磷酸化可受到来自病毒与宿主细胞环境的复杂因素的调控，其详细的分子机制有待进一步的研究予以阐明。

NS5A蛋白的磷酸化形式存在多样性与其在HCV生活史中发挥多种不同的功能有关（表1-2）。HCV replicon复制子细胞模的研究结果显示，NS5A蛋白在HCV病毒基因组RNA的复制中具有重要作用。NS5A蛋白肽链的超磷酸化位点区域的一些突变除了可影响蛋白的超磷酸化作用外，还可显著影响病毒的复制效率。在NS5A蛋白超磷酸化水平低时，HCV的复制效率得到了提高。在一些具有高复制效率的HCV分离株上，其NS5A区段出现突变，一些位点出现在超磷酸化位点区域，这些突变可抑制NS5A的超磷酸化加工。研究还显示，NS5A蛋白与HCV复制中必需的hVAP-33蛋白结合，其结合能力与其超磷酸化水平呈负相关，hVAP-33是一种内质网-高尔基复合体膜蛋白，可与HCV NS5A和NS5B蛋白结合，在HCV复制复合物形成中具有重要作用。对不同磷酸化形式的NS5A蛋白的稳定性的研究结果显示，细胞中NS5A蛋白的半衰期为4～6个小时，超磷酸化的NS5A蛋白的稳定性远远低于基础磷酸化的NS5A蛋白。因此，可认为NS5A蛋白的超磷酸化形式是HCV复制的负调控因素。通过抑制细胞中参与NS5A蛋白超磷酸化加工的磷酸化激酶，抑制NS5A蛋白的超磷酸化，可有效提高细胞中HCV的复制效率。NS5A蛋白还可通过多种途径在HCV复制中发挥重要作用。NS5A蛋白和NS5B蛋白具有直接的相互作用，可能参与了对NS5B RdRp酶活的调控，这种直接相互作用已被证明对于HCV的复制是必需的。研究也发现，NS5A蛋白可与HCV RNA的3′末端结合，可能与复制复合物的形成有关。并且，NS5A蛋白也可通过调控HCV IRES引导的蛋白表达间接影响HCV的复制。目前，对于HCV NS5A蛋白的磷酸化以及调控途径和功能的研究仍在深入开展。

NS5A蛋白可与大量不同的宿主细胞蛋白发生相互作用，参与调控宿主细胞的多种重要的信号传导通路，包括IFN反应、细胞周期控制、细胞增殖与凋亡和细胞应激反应途径等，在HCV复制和感染进程中具有重要作用。NS5A蛋白肽链中有干扰素敏感决定区域（interferon sensitivitydetermining region，ISDR），ISDR及其下游的部分肽段可与dsRNA依赖的蛋白激酶（dsRNA dependent protein kinase，PKR）结合，PKR上与ISDR结合的肽段（244～296aa）也是PKR分子形成二聚体的重要结构域，与NS5A蛋白ISDR的结合可阻断PKR的二聚体化，进而抑制细胞的IFN反应，在HCV的IFN耐受中具有重要作用。目前认为，NS5A蛋白对细胞IFN反应的干扰是导致临床上IFN-α治疗效率低的原因之一。NS5A蛋白还显示出转录激活功能，参与了宿主细胞的生长增殖和细胞内信号转导通路的调节。NS5A蛋白C端的脯氨酸富集肽段可与细胞生长调控相关的接头蛋白Grb2存在直接的相互作用，可干扰细胞MAPK有丝分裂信号通路，Grb2及其下游的MAPK信号通路参与调控多个重要的细胞进程如分裂增殖、蛋白翻译调控等，NS5A蛋白可通过这种相互作用影响宿主细胞的功能。有研究显示，MAPK信号通路也参与了IFN反应的调控，因而NS5A通过对MAPK信号通路的影响也间接调控了细胞的IFN反应。NS5A还可与多种细胞因子产生相互作用调控其功能。NS5A蛋白的C末端脯氨酸富集肽段可与Src激酶家族成员如Hck、Lck、Lyn和Fyn相互作用，可抑制Hck、Lck、Lyn的活性，从而激活Fyn的活性。有研究显示，NS5A蛋白可与细胞抑癌蛋白p53或与其辅因子hTAF（Ⅱ）32相互作用并抑制其功能，进而抑制由p53激活的细胞周期调控蛋白p21的表达，从而调控宿主细胞的增殖，导致细胞转化。此外，NS5A蛋白对PKR的抑制也可导致细胞转化作用，在致肝细胞肿瘤中起到一定的作用。NS5A蛋白与细胞的PI3K-AKT细胞存活信号通路（survival pathway）也可进行相互作用，避免细胞凋亡。NS5A蛋白可干扰TNF途径相关因子TRADD与FADD的相互作用，从而可在细胞中抑制由TNF-α诱导的细胞凋亡。这些抗细胞凋亡的相互作用均可能有利于HCV建立持续感染。NS5A蛋白可与hVAP-33蛋白的C端结合，从而与细胞的脂筏（lipid raft）连接。这种相互作用对于HCV复制复合体在脂筏上的组装非常关键。目前，对于NS5A蛋白与多种宿主细胞因子存在的复杂的相互作用的分子机制，以及这些相互作用对宿主细胞和HCV感染、致病机制的影响的认识仍较为有限，还需要进行更多的研究。

HCV NS5B蛋白的主要功能是RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp），是构成HCV复制复合物的关键成分，其肽链长度为591aa。NS5B蛋白属于膜蛋白中的尾部锚定蛋白，其C末端的长度为21aa的肽段具有很强的疏水性，可形成一个α螺旋的穿膜结构域，可能是NS5B蛋白的膜定位结构域。目前，NS5B蛋白的3维晶体结构已获得了解析，结构分析数据显示，NS5B蛋白N端的530aa残基可形成一个经典的“指、掌、拇指”区域（彩图1-4）。其“指”和“拇指”的相互作用可以形成一个完全环绕的催化位点，完成HCV基因组复制需要的正链和负链RNA的合成。与其他病毒的RaRp比较显示，HCV NS5B蛋白也包含有6个保守的重要基序（motif），依次为A至F。有研究显示，基序A和B内保守氨基酸的突变会导致NS5B蛋白RdRp酶活的丧失，基序C内的保守氨基酸如317位甘氨酸和319位天冬氨酸的突变对酶活的影响相对较小，而基序D内的345位的精氨酸突变为赖氨酸则会增强RdRp的活性。重组表达的NS5B蛋白可在体外合成全长的HCV RNA，说明NS5B蛋白具有解开有高级结构的RNA分子的能力。研究显示，NS5B倾向于与在5′端拥有较复杂二级结构的RNA分子结合，同时其3′端至少含有一个胞嘧啶核苷酸，而并未显示出对HCV RNA分子的识别特异性。HCV具有较高的突变率和重组发生率，这与NS5B蛋白的RdRp功能有直接关系，有研究显示NS5B蛋白在RNA复制过程中会产生复制模板转变（template switch）的现象，即在复制完成前从一个模板结合到另一个模板继续RNA的合成。研究也发现，NS5B蛋白也具有末端核苷酸转移酶（Terminal Nucleotidyl Transferase，TNTase）的活性。NS5B蛋白可在体外可形成寡聚体（oligomers），并且以协同作用的方式催化病毒RNA的合成。其中NS5B蛋白的18位谷氨酸和502位组氨酸被发现在NS5B聚合体形成中是关键氨基酸，而NS5B蛋白的C末端结构未起作用。

HCV RNA的复制是通过由宿主细胞内质网膜系统、多种细胞蛋白和病毒蛋白、及RNA共同组成的复制复合体完成的。NS5B蛋白是组成复制复合体的关键组分。NS5B蛋白可与HCV的一些非结构蛋白发生相互作用。有研究显示，NS5B蛋白可与NS3蛋白的蛋白酶结构域结合并增强NS3蛋白的解旋酶活性，这也说明了在HCV复制过程中NS5B蛋白可调控NS3蛋白的功能。NS5A蛋白与NS5B蛋白存在直接的相互作用，参与了对NS5B RdRp酶活的调控，这种直接相互作用已被证明对于HCV的复制是必需的。NS5B蛋白与多种宿主细胞蛋白也存在相互作用。有研究显示，蛋白激酶C相关激酶（PRK2）参与了NS5B蛋白的磷酸化加工，可能参与了对HCV复制过程的调控。NS5B蛋白的C端肽段与内质网-高尔基复合体膜蛋白hVAP-33的N端肽段存在相互作用，这种相互作用对于HCV复制复合体的形成中具有重要作用。NS5B蛋白可与宿主细胞的亲环蛋白（cyclophilin）B结合使NS5B蛋白的RNA结合能力发生改变，从而影响HCV的复制。目前对于NS5B蛋白与其他病毒蛋白和宿主细胞蛋白的相互作用及其生物学影响的研究仍在深入开展。

在抗HCV药物研究中，NS5B蛋白也是一个十分重要的药物筛选靶点。通过抑制NS5B蛋白的RdRp活性可特异性地抑制HCV的复制。目前以NS5B为靶点进行抗HCV药物的研究已在开展，Sofosbuvir已投入临床，疗效显著（详见第二十四章）。

总之，确定HCV病原体后，经过20年的深入研究，人类对HCV基因组的理解已经十分深入，并在此基础上设计了多靶位的阻断病毒复制的药物，这些药物的高效性获得了充分的保证。虽然如此，鉴于病毒与宿主关系的复杂性，人类尚未完全了解HCV基因组的全部信息，如F蛋白的作用等，仍需要进一步的研究。