第二节　色谱分析法仪器及操作方法

一、色谱分析法概述

1.色谱分析法基本原理

色谱是一种分离技术，把这种分离技术应用到分析领域并与适当的检测手段结合起来，就是色谱分析法。它的基本原理是试样混合物中各组分在色谱分离柱中的两相间不断进行着分配过程。其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。流动相携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，因此与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。由于色谱法的分离效率高于常用分离方法（如重结晶、蒸馏、萃取等），又配有非常灵敏的检测手段，已成为生产、科研等各部门不可缺少的分离分析手段。

2.色谱流出曲线及术语

（1）流出曲线　试样中各组分经色谱柱分离后，流出物通过检测系统时所产生的响应信号随时间或载气流出体积的变化曲线称为流出曲线，如图3-14所示。色谱流出曲线可提供很多重要的定性和定量信息，如：

图3-14　色谱流出曲线

① 根据色谱峰的个数，可判断样品所含的最少组分数。

② 根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析。

③ 根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析。

④ 色谱峰的保留值及其区域宽度是评价色谱柱分离效能的依据。

⑤ 色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。

（2）基线　无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。

（3）保留值

① 时间表示的保留值：

a.保留时间（tR）　组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间。

b.死时间（tM）　不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间。

c.调整保留时间（t'R）　扣除死时间后的保留时间。

t'R=tR-tM

② 用体积表示的保留值：

a.保留体积（VR）：

VR=tRFc

式中，Fc为流动相平均体积流量，mL·min-1。

b.死体积（VM）：

VM=tMFc

c.调整保留体积（V'R）　扣除死体积后的保留体积。

V'R=VR-VM

（4）区域宽度　用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法：

① 标准偏差（σ）　即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。

② 半峰宽（Y1/2）　色谱峰高一半处的宽度Y1/2=2.354σ。

③ 峰底宽（Wb）　Wb=4σ。

（5）分离度R　分离度R是一个综合性指标。它是既能反映柱效率又能反映选择性的指标，定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值，即

一般说，当R<1时，两峰有部分重叠；当R=1时，分离程度可达98%；当R=1.5时，分离程度可达99.7%。

3.定性分析

色谱定性方法采用的保留时间、峰面积等指标受色谱操作条件的影响很大，与组分的结构之间并没有唯一确定的联系，因此色谱原则上不能直接用作定性分析。但在特定条件下，仍可进行一些定性工作。常见的方法有：

① 利用已知纯物质对照定性；

② 利用相对保留值定性；

③ 利用保留指数定性（Kovats保留指数）；

④ 与其他分析仪器联用。

4.定量分析

色谱法定量的依据是当操作条件一定时，某组分的质量或浓度与检测器的响应信号（峰面积或峰高）成正比，即：

式中，mi为i组分的质量；fi为i组分的绝对校正因子，在一定条件下fi为一常数；Ai为i组分的峰面积。

可见，在进行色谱定量分析时需要解决三个问题：准确测量待测组分的峰面积（或峰高）；求出待测组分的校正因子；选择适当的定量方法。

（1）色谱峰面积的测量　色谱工作站可直接提供色谱峰高、峰面积等信息。

（2）定量校正因子

① 绝对校正因子　单位峰面积（或峰高）所代表的物质的质量称为绝对质量校正因子。

fi值与检测器性能、组分和流动相性质及操作条件等因素有关。

② 相对校正因子　某待测组分的相对校正因子为其绝对校正因子与标准物质的绝对校正因子之比。

式中，下标i，s分别代表待测组分和标准物质。

将已知量的某待测物与已知量的标准物质混合均匀后，取适当体积进样，可由两者的峰面积得到相对校正因子。相对校正因子与检测器类型、组分和标准物质性质有关，与操作条件无关。

（3）定量方法　色谱常用的定量方法有标准曲线法、归一化法和内标法。

① 标准曲线法　将待测组分的纯物质配制成不同浓度的标准溶液，然后取固定量的上述溶液进行色谱分析，以峰高或峰面积对浓度作图，应是一条通过原点的直线。分析样品时，在上述完全相同的色谱条件下，取与制作标准曲线时同样量的试样进行分析，测得该试样的响应信号后，由标准曲线查出试样的含量。

此法的优点是操作简单，因而适用于工厂控制分析和自动分析。但结果的准确度取决于进样量的重现性和操作条件的稳定性。

② 归一化法　该法是把试样中所有组分的含量按100%计算，以它们相应的色谱峰面积或峰高为定量参数，通过下列公式计算各组分含量。

当各组分的f相近时，计算公式可简化为：

由上述计算公式可见，使用这种方法的条件是经过色谱分离后，样品中所有组分都要能产生可测的色谱峰。

该法的主要优点是：简便、准确；操作条件（如进样量、流速等）变化时，对分析结果影响较小。这种方法常用于常量分析，尤其适用于进样量很少而其体积不易准确测量的液体样品。

③ 内标法　当只需要测定试样中某几个组分，或试样中所有组分不可能全部出峰时，可采用内标法。具体做法是选取一种与样品性质相近的物质作为内标物，加入到已知待测物质量的样品中，然后进行色谱分析。测量待测物和内标物在色谱图上的峰面积（或峰高），被测组分的质量分数可按以下公式计算：

故　

在测定相对校正因子时，常以内标物本身作为标准物质，则f's=1。式中，mi为被测物质的质量；ms为内标物的质量；m为试样的质量；As为内标物在色谱图上相应的峰面积；Ai为待测物在色谱图上相应的峰面积；f'i为相对校正因子。

由以上计算公式可见，内标法是通过测量内标物及待测组分的峰面积的相对值来进行计算的，因而可以在一定程度上消除操作条件等的变化所引起的误差。

内标法对内标物的要求是：

a.内标物必须是待测试样中不存在的，且是纯度很高的标准物质或含量已知的物质。

b.内标物与欲测组分的保留时间应比较接近且能完全分离（分离度R>1.5）。

c.内标物与欲测组分有比较接近的理化性质（如分子结构、极性、挥发性及在溶剂中的溶解度等）。

d.加入量应与欲测组分含量接近，两者峰面积基本相当。

二、气相色谱法仪器及操作方法

1.气相色谱法

用气体作为流动相的色谱法称为气相色谱法。根据所用固定相的不同，气相色谱法可分为两类：固定相是固体的，称为气固色谱法；固定相是液体的则称为气液色谱法。只要在色谱温度适用范围内，具有20～1300Pa蒸气压，或沸点在500℃以下和分子量在400以下的化学稳定物质，原则上均可采用气相色谱法进行分析。

2.GC-2014气相色谱仪结构及性能

GC-2014气相色谱仪（图3-15）主要由载气系统、进样系统、色谱柱、检测器和数据处理系统组成，其结构如图3-16所示。仪器具有灵活的气路控制方式，不仅可以手动调节，而且配备高精度电子流量控制单元，可同时安装4个进样口、4个检测器，各单元可独立精确控温。

图3-15　GC-2014气相色谱仪　

图3-16　GC-2014气相色谱仪的基本结构

主要性能指标：

① 柱温箱温度范围　室温+10～420℃（使用液态二氧化碳时，-50～420℃）；程序段数为20段（可用降温程序）。

② 进样口　温度约为420℃；进样单元种类有双填充柱、单填充柱、分流/不分流。

③ 检测器单元　FID、TCD、FTD的温度约为420℃；ECD、FPD的温度约为400℃；检测器单元种类有FID、TCD、ECD、FPD，毛细管柱用/填充柱用FTD。

3.操作步骤

① 根据要求配制样品。

② 选择合适的柱子，并安装到SPL进样口及FID检测器上。

③ 打开氮气气源开关，二次压力达到0.7MPa。

④ 打开主机电源开关，在主机自检完成后，打开电脑上实时分析工作站。

⑤ 点击“视图”，选择“仪器监视器”。在流路1监视器窗口中确认：载气及吹扫流量为“打开（on）”状态；FID检测器及点火为“关闭（off）”状态；附加流量控制为“打开（on）”状态；点击“仪器参数”图标，将柱温箱温度设置为30℃，进样口温度设置为40℃，检测器温度设置在150℃以上，然后点击“下载”。

⑥ 待检测器温度上升到150℃以上，打开氢气发生器和空气泵，调节氢气压力表为55kPa，空气压力表为45kPa。然后将工作站中的检测器和点火设置为“打开”状态，等待点火成功。

⑦ 根据样品要求设置进样口，柱温箱温度，实施样品分析检测。

⑧ 当检测结束时，设置进样口温度为40℃，柱温箱30℃，检测器为40℃。点击“下载”，当柱温箱温度降到30℃时，关闭点火和检测器，同时关闭空气和氢气。等检测器温度降到100℃以下，关闭工作站。关闭主机电源。

⑨ 关闭氮气总阀，关掉总电源。

4.注意事项

① 防止明火，注意安全。

② 分析室周围要远离强磁场以及易燃和强腐蚀性气体。

③ 室内环境应在5～35℃范围内，相对湿度≤85%，且室内保持空气畅通，最好安装空调。

④ 载气、空气及氢气需要安装气体净化装置，保证气体纯度。

⑤ 实验时注意观察气泵压力表，以免漏气，及时发现。

三、液相色谱法仪器及操作方法

1.液相色谱法

用液体作流动相的色谱法称为液相色谱法。现代液相色谱法是在经典液体柱色谱法的基础上，引入了气相色谱法的理论，如保留值、塔板理论、速率理论、容量因子和分离度等。在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，所以又称为高效液相色谱法。气相色谱法虽具有分离能力好、灵敏度高、分析速度快、操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、分子量大（>400）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75%～80%）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。液相色谱法根据固定相的性质可分为吸附色谱法、键合相色谱法、离子交换色谱法和尺寸排阻色谱法等。

2.EasySepTM-1010液相色谱仪结构及性能

EasySepTM-1010高效液相色谱仪（图3-17）基本结构如图3-18所示，主要包括贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。仪器为模块化设计，组合灵活，容易从简单的单泵、单检测器升级到二元高压梯度及四元梯度系统。

图3-17　EasySepTM-1010液相色谱仪外形

图3-18　EasySepTM-1010液相色谱仪结构

主要性能指标：

（1）串联式双柱塞往复泵　流量范围为0.001～9.999mL·min-1，以0.001mL·min-1步长调节流量；最高工作压力为42MPa（0.001～9.999mL·min-1）。

（2）紫外/可见检测器　波长范围为190～600nm；光谱带宽为8nm；波长精度为±1nm；波长重复性误差为±0.2nm。

3.操作步骤

（1）准备　流动相所使用的蒸馏水为高纯水，其电阻率是18.2MΩ·cm。所配制的流动相如果含盐，需经过0.45μm的溶剂过滤膜抽滤。流动相应用超声波脱气处理10min。样品建议用流动相配制，并经0.45μm针筒式过滤器过滤。

过滤膜分水性和油性两种，根据流动相的性质选取不同的过滤膜。

（2）开机

① 打开计算机电源开关。

② 打开液相色谱仪的泵和检测器的电源开关，紫外/可见检测器将进行自检。

③ 打开液相色谱工作站对系统参数进行设置，包括流速、测定波长及压力（最大、最小压力）等。

④ 开始运行色谱泵。待检测基线稳定并进行调零后，便可以进行样品测试及数据分析处理。

（3）关机　关闭检测器，用流动相冲洗柱子，关闭泵电源、色谱工作站及计算机。如果暂时几天不进行连续测试的话，要用适当的色谱纯的溶剂冲洗柱子并封端，放入冰箱保存。

（4）注意事项

① 流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质（使用0.45μm或更细的膜过滤）。

② 流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。

③ 不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。

④ 使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子（1h），然后用甲醇（或甲醇水溶液）冲洗40min以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20min以上。

⑤ 长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相（如甲醇等），因为纯水易长霉。

⑥ 每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。

⑦ C18柱绝对不能进蛋白样品、血样、生物样品。

⑧ 堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。清洗方法：a.以异丙醇作溶剂冲洗；b.放在异丙醇中用超声波清洗；c.用10%稀硝酸清洗。

⑨ 气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。

⑩ 如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液，通常在输液前要进行流动相的清洗。

⑪ 要注意柱子的pH值范围，不得注射含强酸、强碱的样品，特别是碱性样品。

⑫ 更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边清洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。