5.8　红茂草中两种生物碱单体的分离与鉴定

5.8.1　材料与药品

UV-1型高效液相色谱仪（日本岛津公司），CP2250型1/10万电子天平（德国Sartorius），DK-98-11A型电热恒温水浴（上海恒科学仪器有限公司），有机玻璃柱（40mm×700mm，广州东巨实验仪器公司）。

红茂草，柱色谱硅胶（化学纯，100～00目，青岛海洋化工厂分厂），白屈菜红碱、血根碱对照品（HPLC均≥98%，阿拉丁生物制品有限公司，批号111718-200501），乙腈、甲醇、磷酸为色谱纯，其他试剂为分析纯。

5.8.2　方法与结果

（1）红茂草中总生物碱的提取

称取红茂草提取物干燥粉末100g，加95%乙醇1L，再加适量氨水，将pH调至9～10，混匀，于90℃水浴中冷凝回流90min，连续提取若干次，合并提取液，放冷，加入硫酸将pH调至1～2，此时产生大量橙红色絮状沉淀，静置过夜，抽滤出沉淀，置于60℃干燥箱中烘干，称定质量，即得红茂草总生物碱硫酸盐。

（2）白屈菜红碱和血根碱的提取与分离

称取红茂草总生物碱硫酸盐50g，加适量氨水将pH调至9～10，混匀；加三氯甲烷200mL，于65℃水浴中冷凝回，流120min，过滤；残渣加三氯甲烷100mL于同样条件下提取，过滤；合并2次提取液，减压浓缩至干，得到紫白色固体粉末。用少量三氯甲烷溶解粉末，待柱色谱分离。另取100～200目柱色谱硅胶300g，经105℃活化60min，用乙酸乙酯调制成糊状，湿法装入有机玻璃柱（40mm×700mm）中，静置过夜，加入样品三氯甲烷溶液，用乙酸乙酯展开至柱底。此时柱子最下层呈橙红色，上层呈现黄色，用95%乙醇洗脱，分别用容器接收橙红色和黄色洗脱液，减压回收乙醇至溶液体积约150mL，分别吸出浓缩液于250mL烧杯中，室温放置2～3d后，黄色部分浓缩液得晶体Ⅰ，橙红色部分浓缩液得晶体Ⅱ。分别滤过2种晶体，用无水乙醇清洗晶体各3次，用氨性无水甲醇重结晶，进一步干燥，称定质量，避光保存。

（3）HPLC鉴定

①色谱条件

Diamonsil ODS，C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μL），流动相乙腈-0.1%磷酸（30∶70），流速1mL/min，检测波长270nm，柱温室温，进样量5μL。

②对照品溶液的制备

准确称取自屈菜红碱对照品20.0mg，置于10mL量瓶中，用甲醇溶解，超声30min，冷却定容，用甲醇定容，用0.45μL微孔滤膜滤过，即得，备用。同法制备0.2g/Ld的血根碱对照品溶液，备用。

③供试品溶液的制备

准确称取晶体Ⅰ和晶体Ⅱ各20.0mg，置于100mL量瓶中，用甲醇溶解，超声30min，冷却定容，用0.45μL微孔滤膜滤过，备用。

④进样顺序

在上述操作条件下，待仪器基线稳定后，连续注入数针标样试液，直至相邻两针生物碱响应值相对变化<1.5%后，按标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行色谱测定。

（4）提取率测定

取前述沉淀，经干燥后称重，得总生物碱约57g，总得率57%。

（5）白屈菜红碱和血根碱纯度的检测

取红茂草提取物100g，经95%乙醇提取后制得总生物碱硫酸盐约57g，取其中50g进行柱色谱分离，分别得晶体Ⅰ和晶体Ⅱ约2.37g、2.14g。HPLC鉴定图5-36，晶体Ⅰ为白屈菜红碱，晶体Ⅱ为血根碱，且2种单体分离度均较高，纯度分别为98.3%，95.6%，说明该分离工艺良好。

5.8.3　结论

硅胶柱色谱是根据混合物质中不同极性成分吸附保留时间的差异，达到分离提纯目的的方法。硅胶表面带有羟基，能与极性物质形成氢键，极性越强的物质与硅胶吸附得越牢固。用不同极性的溶剂对硅胶进行洗脱时，溶剂极性越强，越容易洗脱与硅胶吸附的物质，极性弱的溶剂洗脱能力越差。白屈菜红碱和血根碱同为季铵碱，极性较大，能被硅胶所吸附。在吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的整个层析过程中，制备高纯度白屈菜红碱和血根碱单体。

由于白屈菜红碱和血根碱结构较为相似，因此在浓缩橙红色洗脱液时会有少量白色粉末析出。经HPLC检测，血根碱纯度72.3%，白屈菜红碱纯度25.8%。收集白色粉末，用少量三氯甲烷溶解，经硅胶色谱柱分离得到纯度较高的血根碱，经验证，其纯度与之前分离得到的血根碱晶体相当。

本实验采用硅胶柱色谱法可对红茂草中两种生物碱单体进行分离，整个过程操作简单，得到的产品纯度与对照品相当，是一种较为理想的分离方法。