实训13 黄连的鉴定

【实训目标】熟练掌握黄连的性状、显微及理化鉴别特征，学会双子叶植物根茎类药材的内部构造特点。

【实训准备】

1．实训材料 黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch. 、三角叶黄连Coptis deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao或云连Coptis teeta Wall．的干燥根茎。黄连药材、黄连粉末、黄连永久制片。

2．实训器具 显微镜、紫外分析仪等。

3．实训试剂 稀甘油、甘油醋酸试液、水合氯醛试液、氢氧化钠试液、稀盐酸、含氯石灰、5%没食子酸乙醇溶液、硫酸、乙醇、30%硝酸等。

【实训内容及步骤】

1．性状鉴别

（1）味连：多分枝，集聚成簇，常弯曲，形如鸡爪，单枝长3～6cm，直径0.3～0.8cm。表面灰黄色或黄褐色，粗糙，有不规则结节状隆起、须根或须根残基，有的节间表面平滑如茎杆，习称“过桥”；上部多残留褐色鳞叶，顶端常有叶柄残基。质硬，断面不整齐，皮部橙红色或暗棕色，木部鲜黄色或橙黄色，呈放射状排列，髓部有的中空。气微，味极苦。

（2）雅连：多为单枝，略呈圆柱形，微弯曲，长4～8cm，直径0.5～1cm。“过桥”较长；顶端有少许残茎。

（3）云连：多为单枝，弯曲呈钩状，较细小；长2～5cm，直径0.2～0.4cm。表面棕黄色或暗黄色，折断面黄棕色。“过桥”较短。

2．显微鉴别

（1）横切面：①味连：木栓层为数列细胞；皮层较宽，石细胞单个或成群散在，有根迹维管束；中柱鞘纤维成束或伴有少数石细胞，均显黄色；维管束外韧型，环列，束间形成层不明显，木质部黄色，均木化，木纤维较发达；髓部均为薄壁细胞，无石细胞。②雅连：髓部有石细胞，余同味连。③云连：皮层、中柱鞘及髓部均无石细胞。

（2）粉末：味连黄棕色或黄色。①石细胞：类方形、类圆形、类长方形或近多角形，黄色，壁厚，壁孔明显。②中柱鞘纤维：黄色，纺锤形或梭形，壁厚。③木纤维：较细长，壁较薄，有稀疏点状纹孔。④木薄壁细胞：类长方形或不规则形，壁稍厚，有纹孔。⑤鳞叶表皮细胞：绿黄色或黄棕色，细胞长方形或长多角形，壁微波状弯曲，或作连珠状增厚。⑥导管：为网纹或孔纹导管，短节状。⑦淀粉粒：多单粒，类圆形，直径2～3μm。

雅连与味连相似，但石细胞较多，金黄色，呈不规则条形或长椭圆形。

3．理化鉴别

（1）薄层色谱：①供试品溶液的制备：取本品粉末0.25g，加甲醇25ml，超声处理30分钟，滤过，取滤液，即得。②对照药材溶液的制备：取黄连对照药材0.25g，同法制成对照药材溶液。③对照品溶液的制备：取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。④薄层色谱试验：吸取上述三种溶液各1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺（3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1）为展开剂，置用浓氨试液预饱和20分钟后的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外灯（365nm）下检视。⑤结果判断：供试品色谱中，在与对照药材相应位置上，应显4个以上相同颜色的荧光斑点；在与对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的荧光斑点。

（2）检查：水分不得过14.0%（烘干法）；总灰分不得过5.0%。

（3）浸出物：照醇溶性浸出物测定法（热浸法）测定，用稀乙醇作溶剂，不得少于15.0%。

（4）含量测定：按高效液相色谱法测定。①色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（50∶50）（每100ml中加十二烷基硫酸钠0.4g，再以磷酸调节pH为4.0）为流动相；检测波长为345nm。理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5000。②对照品溶液的制备：取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含90.5μg的溶液作为对照品溶液，即得。③供试品溶液的制备：取本品粉末（过2号筛）约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸（100∶1）的混合溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。④测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，以盐酸小檗碱对照品的峰面积为对照，分别计算小檗碱、表小檗碱、黄连碱和巴马汀的含量，用待测成分色谱峰与盐酸小檗碱色谱峰的相对保留时间确定。表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱的峰位，其相对保留时间应在规定值的±5%范围之内，即得。其相对保留时间见表2-1。

（5）结果判断：本品按干燥品计算，以盐酸小檗碱计，含小檗碱（C20H1 7NO4）不得少于5.5%，含表小檗碱（C20H17NO4）不得少于0.80%，含黄连碱（C19H13NO4）不得少于1.6%，含巴马汀（C21H21NO4）不得少于1.5%。

【实训提示】

1．自制或市售薄层板用前均应活化，活化后置干燥器中保存，备用。为提高薄层展开效果，制备供试品溶液时，应尽量选择极性小的溶剂，溶液浓度要适宜，使普通薄层板的点样量不超过10μl，高效薄层板不超过5μl，以免因点样量过多而造成原点“超载”，展开剂绕行，斑点拖尾。

2．采用微量注射器或定量毛细管点样时，不得损坏薄层表面，点样速度要快，在空气中点样以不超过10分钟为宜，以减少薄层板和大气的平衡时间。

3．实训环境的相对湿度和温度对薄层分离效果有着较大的影响，一般要求实训室相对湿度应低于65%。

4．展开容器应使用适合薄层板大小的专用薄层色谱展开缸，并有严密的盖子，底部应平整光滑，或有双槽。展开前需用展开剂对展开缸进行预平衡15～30分钟，以防止边缘效应；展开距离不宜过长，通常为10～15cm；展开缸的玻璃槽口与盖的边缘磨砂处应涂抹甘油淀粉糊（展开剂为脂溶性时）或凡士林（展开剂为水溶性时），使其密闭；应注意展开过程中的恒温恒湿；展开剂应新鲜配制，所用溶剂纯度应高，应分别量取后再混合，不得在同一量具中累积量取。

5．高效液相色谱仪应按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中《实验室液相色谱仪检定规程（JJG705-90）》的规定定期检定，并符合规定；仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪声和漂移应能满足分析要求。在使用前应详细参阅仪器操作说明书。

6．应采用高纯度的色谱纯溶剂配制流动相，分析纯或优级纯溶剂有时亦可采用，但需进行除去紫外杂质、脱水、重蒸等纯化操作；水应为新鲜制备的高纯水，可用超级纯水器制得或用重蒸馏水；凡规定pH的流动相，应使用精密pH计进行调节；为防止不溶物堵塞流路和色谱柱入口处的微孔垫片，应预先除去流动相中的任何固体微粒，可在玻璃容器内蒸馏，亦可用0.45μm以下的微孔滤膜滤过。

7．所用的流动相必须预先除去其中的空气，习称脱气。常用的脱气方法有超声脱气、惰性气体（He）鼓泡吹扫脱气和加热脱气等。超声脱气法是将盛有流动相的容器置于超声水浴中，超声振荡约15分钟，是目前用得最多的脱气方法。应配制足量的流动相备用。

8．定量测定时，对照品溶液和供试品溶液均应分别配制2份。供试品溶液在注入色谱仪前，一般应经适宜的0.45μm滤膜滤过；必要时，在配制供试品溶液前，样品需经预净化，以免对色谱系统产生污染或影响色谱分离。

9．检查上次使用记录和仪器状态，检查色谱柱是否适用于本次实验，色谱柱进出口位置是否与流动相的流向一致，原保存溶剂与现用流动相能否互溶，流动相的pH与该色谱柱是否相适用，仪器是否完好。

10．缓冲液应新鲜配制，必要时可放在冰箱内贮存，以免产生霉菌并堵塞色谱柱和系统，贮液器应定期用酸、水清洗，特别是盛水和缓冲液的瓶子，以免发霉。

11．压力表无压力显示或压力波动时不能进行分析，应检查泵中气泡是否已排除，各连结处有无漏液，排除故障后方能进行操作。如压力升高，甚至自动停泵，应检查柱端有无污染堵塞。

12．发现记录基线波动，出现毛刺等现象，首先应考虑检测器流通池中是否有气泡或污染，如不是流通池引起，可等待氘灯稳定，同时检查仪器的接地是否良好，必要时，换上新的氘灯，仪器稳定后方能进行操作。

13．进样前，色谱柱应用流动相充分冲洗平衡，如系统适用性不符合规定，或填充剂已损坏，则应更换新的同类色谱柱进行分析，由于同类填充剂的化学键合相的键合度及性能等存在一定差异，往往依法操作达不到预定的分离时，可更换另一牌号的同类色谱柱进行试验。

14．以硅胶作载体的化学键合相填充剂的稳定性受流动相pH的影响，使用时，应详细参阅色谱柱说明书，在规定的pH范围内选用流动相，一般的pH范围为2.5～7.5。使用高pH流动相时，可在泵与进样器之间连接一硅胶短柱，以饱和流动相，保护分析柱，并尽可能缩短在高pH下的使用时间，用后立即冲洗。

15．分析完毕后，色谱流路系统应充分冲洗，特别是用过含盐流动相的，更应注意先用水，再用甲醇-水充分冲洗，如发现泵漏液等较严重的情况，应请有经验的维修人员进行检查、维修。各色谱柱的使用应予登记，注明本次测试药品及柱中的保存溶剂。

【实训报告与考核】

1．绘黄连根茎横切面简图及粉末特征图；记录理化鉴定结果。

2．将综合鉴定结果与药品标准相比较，判断供试品是否符合规定。