实验三 动物组织总RNA的提取
实验目的
（1）掌握动物组织RNA提取的一般原理。
（2）通过提取动物组织RNA，掌握TRIzol法提取RNA的方法和步骤。
实验原理
TRIzol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA，酸性条件使RNA与DNA分离，加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白（图2-1）。
图2-1 动物组织总RNA提取流程图
RNA的完整性对于后续实验至关重要。而导致RNA降解最主要的物质为空气中的RNase。RNase非常稳定，在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后又迅速复性。用常规的高温高压蒸汽灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验中，应注意以下几个方面。
①经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌、霉菌可能成为RNase的来源。
②使用灭过菌的RNA专用塑料制品，避免交叉污染。
③RNA提取过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。
试剂与仪器
1.试剂和溶液
（1）TRIzol试剂。
（2）无RNase水 将水加入处理过的不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.05％（体积分数），充分混匀后37℃放置过夜，高压灭菌。
（3）75％乙醇、氯仿、异丙醇、去离子水、高盐溶液（0.8mol/L柠檬酸钠和1.2mol/L NaCl）、DEPC。
2.仪器设备
离心机、制冰机、匀浆器、1.5mL离心管（RNase-free）、枪头（RNase-free）、超净工作台、高压灭菌锅、移液器、烘箱、冰箱。
实验步骤
（1）实验准备
①采用DEPC配制的75％乙醇擦洗台面及相关仪器设备表面。
②在玻璃和塑料制品中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1％，室温处理过夜，将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住用含DEPC水处理过的玻璃和塑料制品，高温高压蒸汽灭菌至少30min。
③玻璃和金属物品在250℃下烘烤3h以上。
（2）实验步骤
①匀浆：每50～100mg组织加入1mL TRIzol，用匀浆器进行冰上匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积的10％。
②将匀浆样品在室温（15～30℃）放置5～15min，使核酸-蛋白复合物完全分离。
可选步骤：如样品中含有较多蛋白质、脂肪、多糖（如肝脏和肌肉中的糖原）或胞外物质（肌肉），可于2～8℃12000r/min离心10min，取上清液。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量基因组DNA，上清液中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液转入1.5mL离心管中进行下一步操作。
③每1mL TRIzol加入0.2mL氯仿，剧烈振荡60s（可使用混匀器，也可手动剧烈颠倒混匀），室温放置5～15min。
④4℃ 12000r/min离心15min。样品分为三层：底层为红色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60％（即1mL最多600μL，为保证RNA质量，可适量减少抽取量，防止抽到下层）。
⑤记录抽取水相的量，把水相转移到新的1.5mL离心管中，用等体积的预冷的异丙醇沉淀水相中的RNA。
a.每使用1mL TRIzol加入0.5mL异丙醇，室温放置10min。
b.可选：应对糖原含量较高的组织（如肌肉和肝脏），每使用1mL TRIzol在水相中加0.25mL异丙醇和0.25mL高盐溶液（0.8mol/L柠檬酸钠和1.2mol/L NaCl）混合离心，这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，沉淀出RNA。
⑥4℃ 10000g离心10min，离心前看不出RNA沉淀（肌肉和肝脏等富含糖原的组织可能出现大量糖原沉淀），离心后在管侧和管底出现白色半透明状沉淀。弃上清液。
⑦向1.5mL离心管中加入75％乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1mL TRIzol至少加1mL 75％乙醇。4℃不超过7500g离心5min，弃上清液。
⑧室温放置于超净台通风口（垫上已灭菌的吸水纸）干燥RNA沉淀，晾5～10min即可，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入适量DEPC水，记录使用的DEPC水体积（适量是指加入水后仍能保证RNA浓度至少≥0.5μg/μL，但不影响溶解，浓度在4μg/μL以上的RNA较容易出现溶解不完全的情况），使之充分溶解（可选择4℃放置1h以上或55～65℃水浴10min），之后才可以进行浓度测定、RNA变性电泳等后续操作，RNA应尽快转移至-70℃保存。
思考题
RNA提取过程中如何防止DNA污染？