实验二　动物组织DNA的提取

实验目的

（1）了解真核生物DNA提取的一般原理和方法。

（2）通过动物组织DNA的提取，掌握DNA提取的方法和步骤。

实验原理

真核生物的核糖核酸（RNA）与脱氧核糖核酸（DNA）大部分与蛋白质结合形成核蛋白。因此，制备真核DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。

RNA核蛋白和DNA核蛋白在不同浓度氯化钠溶液中的溶解度有显著区别。DNA核蛋白在0.14mol/L氯化钠中溶解度低，但在1～2mol/L氯化钠中溶解度高；RNA核蛋白在0.14mol/L氯化钠中仍有相当大的溶解度，所以调节氯化钠浓度，可使RNA核蛋白和DNA核蛋白分步提取。

提取DNA的一般过程是将分散好的组织在SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。其中，苯酚的作用是使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA连接键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶，蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相；氯仿可加速有机相与液相分层，最后用氯仿抽提去除核酸溶液中的酚（酚易溶于氯仿中）；异戊醇有助于消除抽提过程中产生的气泡，同时，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含有DNA的水相、中间的变性蛋白质相及下层的有机溶剂相维持稳定。

试剂与仪器

1.试剂与溶液

（1）组织或细胞裂解缓冲液

（2）蛋白酶K　称取20mg蛋白酶K溶解于1mL灭菌的双蒸水中，-20℃保存备用。

（3）TE缓冲液（pH8.0）　高压灭菌，室温保存。

（4）酚:氯仿:异戊醇=25:24:1。

（5）异丙醇、冷无水乙醇、70％乙醇、灭菌水、7.5mol/L乙酸氨。

2.仪器与设备

恒温水浴锅、台式离心机、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）、吸水纸、冰箱。

实验步骤

（1）取新鲜或冰冻动物组织块（如异育银鲫肝脏或肌肉）0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1mL的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5mL离心管中，加入蛋白酶K（500μg/mL）20μL，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min（也可转入37℃水浴12～24h），期间间歇振荡离心管数次，12000r/min离心5min，取上清液转入另一离心管中。

（2）加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100μL吸头挑出，晾干，用200μL TE缓冲液重新溶解（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）。

（3）加等量的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）振荡混匀，12000r/min离心5min。

（4）取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿:异戊醇（24:1），振荡混匀，12000r/min离心5min。

（5）取上层溶液至另一离心管中，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸铵（中和DNA表面的电荷，促进沉淀）和2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min，12000r/min离心10min。

（6）小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。

（7）用1mL 70％乙醇洗涤沉淀物1次，12000r/min离心5min。

（8）小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。

（9）加200μL TE缓冲液重新溶解沉淀物，然后置于4℃或-20℃保存备用。

思考题

（1）整个DNA提取过程中应该注意什么？

（2）列出DNA提取过程中所需的试剂及溶液，并说明各试剂或溶液的作用。