（二）神经组织的一般染色技术

神经系统的一般组织学染色技术是神经解剖学研究中常用的方法。要进行神经组织微细结构的观察，首先需对神经组织标本进行一系列处理后切成薄片，再进行染色，然后才能在显微镜下观察。

1.组织切片的制备　在进行组织切片前先要进行组织固定和包埋。

（1）组织固定　固定是指将组织浸入化学试剂内，通过化学试剂的作用，使组织细胞的形态结构保存下来的一种方法。组织固定是组织切片制备的重要步骤之一，不仅用于一般的组织切片染色，也是组织化学、免疫组织化学、原位杂交、电镜等技术成败的关键环节。

1）常用的固定方法　主要有浸泡固定和灌注固定两种。①浸泡固定：将组织块直接浸泡在固定液中，一般固定液的量应为组织块的15～20倍。②灌注固定：通常经左心室至升主动脉将固定液灌注在动物体内，同时剪开右心耳，灌注固定液的量至少是动物血液量的两倍以上。为了避免血凝块堵塞小血管，一般在灌注固定剂前，先用生理盐水冲去血液。

2）常用的固定剂　固定剂可分为单一固定剂和混合固定剂。前者指选择一种化学试剂作为组织固定剂，如乙醇、甲醛、四氧化锇（锇酸）等。后者指用两种或两种以上的化学试剂按一定比例混合后作为组织固定剂，目的在于使这些化学试剂可以通过各自的优缺点相互弥补，从而成为较完美的固定剂。

（2）组织包埋　将固定的组织块经过脱水等处理、充分浸透包埋剂后，再置于包埋剂内冷却，这个过程称为包埋。常用的组织包埋方法根据包埋剂的不同可分为石蜡包埋、火棉胶包埋、低黏稠度硝化纤维包埋及明胶包埋等。

（3）组织切片　组织切片的方法较多，几种常用方法如下。

1）石蜡切片法　是神经解剖学研究中最为常用的切片制作技术。采用石蜡切片机切片，如无特殊要求，切片厚度一般为5～10μm，将切片机切下的蜡带放于恒温水浴中展开后贴于经过处理的载玻片上，放入温箱内烘干后，再经脱蜡、染色后在显微镜下观察。

2）冰冻切片法　将组织块制冷后进行切片，也是神经解剖学常用的切片方法之一，目前最常用的为恒冷箱切片法。这是将切片机置于类似冰箱的恒冷箱内，使切片机保持恒定的低温状态，组织块不致解冻的方法。本法的优点是可切较薄的连续冰冻切片，切片厚度在10～100μm，更适用于细胞化学和免疫细胞化学的研究。

操作时将新鲜固定或不经固定的组织用液氮、干冰等冷冻后置于恒冷箱内切片，也可将组织块直接放置在恒冷箱内，经过组织吸热器处理后切片，为防止组织内的水分形成冰晶，在冰冻前需将组织放入一定浓度的蔗糖内浸透。

3）振动切片法　使用振动切片机进行切片，利用振动器使刀片进行横向振动，同时缓慢向前进刀，以切割浸泡在液体中的组织块，其切片厚度范围为20～500μm。用此种方法切片，无需包埋或冰冻，具有更好地保持组织的成分及酶活性，并可避免冰晶造成的组织破坏等优点，尤其适用于组织化学及免疫电子显微镜技术的切片观察。

4）超薄切片法　此法制作的超薄切片适用于透射电镜下观察。前期组织块一般用多聚甲醛和戊二醛的磷酸缓冲液做预固定，然后用四氧化锇的磷酸缓冲液做后固定，组织块采用丙酮脱水，包埋剂多用环氧树脂。在超薄切片机上用玻璃刀或钻石刀切片，切片厚度不超过0.1μm。切片用醋酸双氧铀及枸橼酸铅等进行染色后，在透射电镜下观察。

2.神经组织切片染色　染色是指组织或细胞的某些成分与染料经化学结合或物理吸附作用而显色，以便于显微镜下观察。下面介绍几种常用的染色方法。

（1）苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）法　简称HE染色法。是组织切片染色技术中应用最广泛的染色方法。苏木精是阳离子染料，能将细胞核内的嗜碱性物质染成蓝紫色；伊红是阴离子染料，可将细胞质和胶原纤维等染成粉红色。但HE染色不能很好地显示神经元的尼氏体、神经纤维的髓鞘、神经末梢、胶质细胞等，显微镜下观察这些结构还需采用其他的特殊染色方法。

（2）Nissl染色法　是一种经典的神经组织特殊染色方法。根据神经元内的主要成分核酸（脱氧核糖核酸和核糖核酸）具有嗜碱性的特点，采用碱性染料进行染色。神经元胞体中大量核糖核酸主要以尼氏体的形式存在，可与碱性染料结合，而细胞核中染色质少，故染色浅，但核仁含有丰富核糖核酸和一层脱氧核糖核酸外壳，故核仁染色较深。

通过Nissl染色，尼氏体、细胞核和核仁清晰可辨，而且容易区分树突（有尼氏体）和轴突（无尼氏体）。在生理情况下，尼氏体数量多，反映神经元合成蛋白质的功能较强；而神经元受损时，尼氏体的数量可减少甚至消失，因此可通过对尼氏体的观察来了解神经元的损伤和恢复情况。另外神经胶质细胞核内染色质较丰富，故尼氏染色着色较深，但胞浆不着色。Nissl染色使用的碱性染料主要有焦油紫（又称甲酚紫、克紫、焦油固紫）、硫堇、甲苯胺蓝和棓花青等。

（3）镀银染色　是显示中枢神经系统神经元形态结构的染色方法，不但能显示神经元的胞体，也可显示神经纤维、神经末梢以及溃变的神经纤维等。

1）Golgi法　是用硝酸银镀染显示完整的神经元轮廓及突起的走向。现在Golgi原法已有很多改良方法。Golgi镀染神经元的机制至今不清。

2）Cajal法　主要镀染神经元内的神经原纤维，从而可以显示轴突末梢和其他胞体之间的联系。

（4）髓鞘染色　髓鞘是神经纤维的被膜，髓鞘的染色观察对研究神经纤维的联系、变性和再生有重要的意义。

1）Weigert法　先用金属化合物如铬、铜、铁盐等对神经组织、特别是髓鞘进行媒染，再用苏木素染色，使髓鞘染成深蓝色至黑色。Weigert法目前是显示髓鞘的最佳方法。

2）Marchi法　是用锇酸专门显示变性髓鞘的染色方法。本法广泛应用于变性有髓纤维束的追踪。Marchi法染色可使变性髓鞘及脂肪呈黑色，背底呈黄至浅棕色，只适合有髓纤维。

3）Nauta法　是一种显示变性纤维或终末的改良镀银法。此法用高锰酸钾对神经组织进行前处理，以降低组织还原力，并抑制正常纤维嗜银性，从而可以追踪到终末前、显示变性纤维靠近终末部分的变性。Nauta的溃变银染法为研究中枢神经系统纤维联系提供了重要方法。