1.2 生物光子学简介
生物光子学（Biophotonics）是由光学（特别是激光科学）和生命科学交叉形成的新兴前沿学科。对于这个交叉学科，很难精确地界定其研究范围。在内涵上，生物光子学包括生物中和光相关的研究，以及光学中和生物相关的研究。例如，光学已经在细胞生物学、分子生物学、组织生物学、神经科学、基因工程、干细胞研究、癌症科学、蛋白质组学，乃至大量的病理科学、重大疾病研究与治疗、临床诊断、再生科学以及特殊医疗器械等领域中快速发展和广泛应用。因此，人们也习惯把生物光子学称为生物医学光子学。而在外延上，由于生物光子学在大量研究中已经达到了单分子和单光子水平，它已经广泛地与纳米科学、材料科学、量子信息科学等相关领域紧密结合，出现了进一步的学科交叉。一个较为有趣的现象充分说明了生物光子学的交叉性和多样性，那就是世界上的生物光子学实验室会设立在高校的各类院系中，如物理（物理光学与生命科学交叉）、生命科学（生物学与光学交叉）、生物医学工程（生物学与光学工程交叉）、电子工程（光电子科学与技术）、材料、化学、物理化学等院系。同样，与生物光子学相关的科学论文也广泛分布于以上各领域的学术期刊中。
正如很难界定生物光子学的研究范围，我们也同样无法精确地以某个标志性事件作为其发展的起点。如前所述，不少科学家以显微镜的出现作为生物光子学诞生的象征，主要因为显微成像是第一种与生命科学结合非常深入的技术。然而，在激光技术出现之前，显微镜作为一种生物研究的基本工具，一直没有实质上的技术进步。此时的“生物光子学”仅仅是生物领域的一个附属技术方面或光学研究的技术应用，远未达到独立学科的程度。类似地，将采用光合作用的研究作为生物光子学发展的起点同样不合适。光合作用更多的是一种光化学过程，参与其中的光子除了提供能量，并不具备光学的其他特性。
随着分子特异性荧光标记概念的提出和应用，相关生物学领域得到了前所未有的发展，并从根本上促进了整个生命科学的进步。在此之前，透射型显微镜基本上只能获得生物样本的结构信息。即使通过对照明和传导部分的改进，人们研究出了相衬（Phase Contrast）成像、微分干涉对比（Differential Interference Contrast）成像、暗场（Dark Field）显微镜成像等成像方法（其中相衬成像和偏光显微镜成像如图1.11所示），也仅仅只能提高成像的反衬度等参数，而不能给显微成像提供更多的信息。因此，对于折射率几乎均匀、非常透明的细胞而言，这些成像方法很难带来实质性的进展。与之相对的，特异性分子荧光标记，使人们可以直接在活体条件下观测亚细胞的精细结构以及细胞内的特异性分子等，这为相关的生物学发展提供了前所未有的重要工具。
图1.11 口腔上皮细胞的相衬成像和卵母细胞的有丝分裂偏光显微镜成像
生物荧光激发和观测在客观上要求有更好的激发光和检测手段，也使得激光的众多可控特性获得了充分应用。激光技术的出现将荧光显微领域推向了巅峰，激光共聚焦扫描显微镜就是其中的代表，它使人们首次在三维空间尺度上直接观测到分辨率达到光学衍射极限的特异性标记的荧光图像，由此进一步衍生出了各种荧光激发、转换和测量技术，使得细胞和分子生物学紧密地与激光技术联系起来，大大促进了这些领域的研究。其中，全内反射荧光（Total Internal Reflection Fluorescence，TIRF）成像、荧光寿命成像（Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy，FLIM）、荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）成像、荧光自相关光谱（Fluorescence Correlation Spectroscopy，FCS）测量等，都在特异性分子之外提供了更多的分子的时间、空间信息，人类对于生命现象、结构和过程的理解首次达到了亚细胞和分子级别。TIRF成像和FRET成像如图1.12所示。值得注意的是，荧光成像检测方法也大量地进入了基因组学和蛋白组学中，为分子生物学和生物医学分子检测的发展提供了极其重要的关键技术。这些发展也使得人们逐步对激光与生物学的交叉问题重视起来，并有一批科学家从各个领域转入到这个交叉领域进行更加专门和深入的研究。显微成像技术在近30年内，一直是生物光子学领域最核心、最前沿、最主流的方向，也是取得进展最多、在生命科学中影响最大的方向。
光子的粒子性为激光在生物中的应用提供了新的方向。光镊技术的出现，使得生物光子学进入了爆炸式的发展阶段，是生物光子学成为一门独立学科的里程碑。不同于过去依附于生物研究的工具，光镊更多的是一种不同于以往的全新的研究思路和研究切入点，从而使得生物光子学发展为一门真正的独立学科成为可能。光镊技术充分体现了激光的粒子性和空间精度的特性。由于光镊的强度与聚焦程度相关，人们由此转而研究光束的紧致聚焦特性，而这正是大部分生物光子学研究的实验基础。由于长时间的关注，人们大大加深了对细胞光损伤的理解，并开始重视一系列生命细胞对光的应激反应，从而更加深入地探讨光子在生命系统中的传播、吸收、荧光转换等基础问题，这为今后生物光子学的全面发展打下了理论和实验基础。
图1.12 TIRF成像（a）和FRET成像（b）
紧致聚焦的激光带来了超高的光子密度，让聚焦的局域空间的电场强度达到了非常高的量级，这会使焦点内物质的分子结构被破坏。因此，人们尝试用激光取代传统的物理手术刀，让它成为一种洁净、精密、无接触无侵入的对细胞进行操控的“手”。随着激光输出波长向紫外波段的拓展以及调Q脉冲激光器的出现，人们开始尝试用激光对细胞做精密的手术。例如，对两个细胞做融合，在细胞膜上钻孔，甚至直接在细胞内部切断一个染色体。在传统的机械手术刀时代，这种精度的手术是无法想象的。调Q形成的纳秒级的脉冲也让生物样本中的非线性过程成为可能。尽管当时这些尝试都不太成功，大量生物样本往往由于受到过多的激光损伤而死亡或失活，但这些早期技术探索也为后续的研究奠定了重要的前期基础。
光镊概念的引入很快就在技术上发展到了极限。随着飞秒激光技术的出现和成熟，超高的飞秒脉冲的峰值功率带来了高效的非线性，使得生物光子学出现了又一次突破。在20世纪90年代初，人们已经开始将飞秒激光的非线性过程用于细胞成像的荧光激发。一系列的非线性成像技术很快在细胞和组织中得到了广泛的应用。由于飞秒脉冲优异的时域特性，它在组织中具备了比连续光或长脉冲好得多的传播优势。所以，组织中的荧光非线性成像随着飞秒激光技术的发展而取得了很多重要的成果，特别是表征生物样本内部分子信息的谱线探测技术，在生物分子信息、癌症以及重大疾病的检测上得到了非常好的发展和应用。
进入21世纪，越来越多的物理概念和思想被引入到生物研究中。例如，传统的流式细胞仪结合散射和荧光谱线探测等技术，可以同时检测多种生物信息。通过激光在电介质表面形成的等离子体对光相位的影响，可以测量到生物分子对介质折射率的微小改变。这些研究又进一步与纳米科学和材料科学相结合，促进了生物传感的飞速发展。而在相关生物医学应用方面，基于激光激发的光动力治疗技术，逐渐在临床上做出了相应的尝试，并在某些疾病的治疗上取得了不错的结果。在人的组织水平上，利用激光相干性探测组织结构的光学相干断层扫描（Optical Coherent Tomography，OCT）技术也迅速地在临床应用方面发展。角膜的OCT成像如图1.13所示。
图1.13 角膜的OCT成像
近年来生物光子学领域最重大、最引人瞩目的成果，则是一系列超分辨率成像技术，包括随机光学重建显微（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM）技术、光激活定位显微（Photoactivated Localization Microscopy，PALM）技术、受激发射损耗（Stimulated Emission Depletion，STED）显微技术。通过特殊的荧光转换蛋白或荧光分子，巧妙地把空间问题转换为时间问题，远场荧光显微镜的分辨率已突破衍射极限，达到并突破了10 nm的量级。此外，利用激光受激辐射的概念和飞秒激光精密的时域特性，科学家们用纯光学的手段也获得了10 nm量级的成像分辨率。这一系列成像技术的突破，给细胞分子生物学和神经科学的研究带来了许多重要的结果。图1.14所示为整个动物细胞中线粒体的3D STORM成像。
图1.14 整个动物细胞中线粒体的3D STORM成像
与成像对应，利用飞秒激光对细胞的精确手术和离子调控也在近年取得了很多重大的突破。飞秒激光的长脉冲间隔和波长对于生物样本较为安全，可以对生物样本进行较长时间的照射，因此具有衍射极限精度的精密细胞手术在转基因、细胞生理过程和骨架的研究，以及细胞融合、神经组织再生、分子信号调控等众多领域都取得了很好的进展。
目前，生物光子学处于史无前例的高速发展时期。美国、欧盟、日本正在进行的脑计划，其中生物光子学（特别是光学显微成像技术）都是关键部分。此外，美国在荧光蛋白的荧光转换、激光诱导神经再生、激光控制基因表达等领域取得了NSF和军方的5~10年期的重点资助。德国、英国、俄罗斯等国家也纷纷加大了对生物光子学领域研究的投入。我国近年来在生物光子学领域的支持也显著增强，无论是大科学的脑计划，还是生物光子学的关键技术，例如各种新型的生物光子学成像方法、面向医学应用的多模态成像等，都获得了国家一系列的重大支持。可以想象，在现在以及不久的将来，生物光子学将会进一步高速发展，取得更多、更重要的成果，为探索生命科学的奥秘做出重要的贡献。