三、实验内容

（一）线粒体的活体染色

1.原理

线粒体是真核细胞内一种重要的细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞各项活动所需要的能量，主要通过线粒体呼吸作用来提供。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿 B（Janus green B）是线粒体的专一性活体染色剂，具有脂溶性，能跨过细胞膜，解离后，有染色能力的基团带正电，结合在带负电的线粒体内膜上。内膜的细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态，呈现蓝绿色，而在周围的胞质内，染料被还原成无色。

线粒体浸没在染液中能维持活性数小时，使我们能够直接看到生活状态线粒体的外形、分布及运动。

2.方法与结果

（1）家兔肝细胞线粒体的活体染色：用空气栓塞法处死家兔，将其置于解剖盘内，迅速打开腹腔，取兔肝边缘较薄的肝组织一小块（2～3mm3），放入盛有Ringer液的平皿内洗去血液（用镊子轻压），用吸管吸去Ringer液，在平皿内加1/300詹纳斯绿B染液，让组织块上表面露在染液外面，使细胞内线粒体的酶系可进行充分氧化，这样才有利于保持染料的氧化状态，使线粒体着色。当组织块边缘染成蓝色时即可，一般需要染30min。

染色后，将组织块移到载玻片上，用镊子将组织块拉碎，就会有一些细胞或细胞群从组织块脱离。将稍大的组织块去掉，使游离的细胞或细胞群留在载玻片上，加1滴Ringer液，盖上盖玻片，吸去多余水分。显微镜观察，肝细胞质中许多线粒体被染成蓝绿色，呈颗粒状（图2-1）。

图2-1　家兔肝细胞中的线粒体

（2）人口腔黏膜上皮细胞线粒体的活体染色：用牙签刮取口腔黏膜上皮细胞涂于清洁的载玻片上，滴加詹纳斯绿B染液，在室温下染色15min，覆以盖玻片，盖破片下两侧可放头发丝支撑，使不压迫细胞并蓄纳较多染液，如果观察时间较长，可适当添注染液。

用40×物镜观察即可见到蓝绿色的线粒体，细胞质接近无色。注意该染液有轻微毒性，若染色过久，线粒体可能发生溃变，出现空泡。

（二）线粒体的光镜切片观察

用詹纳斯绿B染色的兔肝细胞光镜切片，肝细胞中的线粒体呈蓝绿色的颗粒。

（三）线粒体的电镜照片观察

不同细胞中线粒体的形态和数目不同。线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。

线粒体嵴的数目与分布方式是多种多样的。一般与线粒体长轴垂直排列，但也可见到与线粒体长轴平行排列的嵴。嵴的横切面呈囊状或管状。嵴的数量与细胞呼吸功能的强度有很大关系。以下一组照片是电镜下观察到的线粒体（图2-2）。

图2-2　电镜下的线粒体