第三节　核糖核酸提取

核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）存在于生物细胞和部分病毒及类病毒中的遗传信息载体，75%存在于细胞质中，10%在细胞核内，15%在细胞器中。RNA是由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成的长链状分子。RNA的主要功能是实现遗传信息在蛋白质的表达，是遗传信息向表型转化过程中的桥梁。

RNA的一个核糖核苷酸分子由磷酸、核糖和碱基构成，RNA的碱基主要有4种，即腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、尿嘧啶（U），其中U取代了DNA中的胸腺嘧啶（T）。

一、RNA的理化性质

RNA一般为单链长分子，不会形成双螺旋结构，但是很多RNA也需要通过碱基配对原则，形成一定的二级结构乃至三级结构来行使相关的生物学功能。RNA碱基配对规则与DNA稍有差异，不过除了A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。

根据结构和功能的不同，RNA主要分为三类，即转运RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA）、信使RNA（mRNA）。mRNA是蛋白质合成的模板；tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是核糖体的组成组分，是合成蛋白质的场所（图3-2）。

很多病毒只以RNA作为其唯一的遗传信息载体（有别于细胞生物普遍用双链DNA作载体）。在RNA病毒中，RNA是遗传物质，植物病毒总是含RNA。类病毒不含有蛋白质的闭环单链RNA分子，此外，真核细胞中还有两种类型的RNA，即不均一核RNA（hnRNA）和小核RNA（snRNA）。hnRNA是mRNA的前体；snRNA参与hnRNA的剪接（一种加工过程）。自1965年酵母丙氨酸tRNA的碱基系列确定以后，RNA序列测定方法不断得到改进。除多种tRNA、5S rRNA、5.8S rRNA等较小的RNA外，尚有一些病毒RNA、mRNA及较大RNA的一级结构测序已完成，如噬菌体MS2RNA含3569个核苷酸。

细胞中还有许多种类和功能不一小型RNA，像是组成剪接体（spliceosome）的snRNA，负责rRNA成型的snoRNA，以及参与RNAi作用的miRNA与siRNA等，可调节基因表达。而其他如Ⅰ、Ⅱ型内含子、RNaseP、HDV、核糖体RNA等都具有催化生化反应过程的活性，即具有酶的活性，这类RNA也被称为核酶。

二、RNA分离纯化的原则

RNA的戊糖残基上2′和3′位都带有羟基，因此RNA应该比DNA化学性质更活跃，易被RNase降解。与DNase不同，RNase催化反应不需要二价金属离子的辅助，不能被缓冲液中的金属螯合剂如EDTA等抑制其活性。RNase具有链内二硫键，可以抵抗比较长时间的煮沸和温和的变性剂。因此，RNA分离纯化的最基本原则是利用RNase抑制剂和含有强变性剂的裂解液灭活外源和内源RNase，同时保持低温，防止RNA被降解。此外，RNA在碱性溶液中不稳定，在分离纯化RNA过程中应严格控制缓冲液的pH值。

三、总RNA分离纯化的基本原理与方法

在异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法基础上发展起来的Trizol一步法，已成为提取RNA的主流方法。Trizol是总RNA提取试剂，可以直接从组织或细胞中提取到总RNA，且其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，迅速破碎细胞同时抑制细胞释放出的核酸酶。各生物公司开发的商品化试剂Trizol虽然名称不同，但主要成分差不多，在具体使用过程中应遵循开发商提供的技术资料。经过该法提取RNA的总量与其在组织和细胞中的含量有关，一般能获得4～7µg/mg或者5～10µg/10⁶个细胞的量，获得的RNA纯度也比较好。和基因组DNA的分离纯化类似，RNA的分离纯化大致分为准备工作，材料的选择，RNA的释放、纯化、浓缩和保存等主要步骤。

（一）材料的选择

组织或细胞的基因表达具有时间和空间特异性，因此其产生的RNA总量是不一样的。用于提取RNA的材料依据实验目的和实验对象来选择。理论上幼嫩的组织、处于生长旺盛期的组织与旺盛分泌蛋白的组织中RNA含量都比较高，例如全血、肝脏等。

（二）临床常见的标本具体预处理方法

1.血液

一般需要使用新鲜的血液，经淋巴细胞分离液分离到有核白细胞后，加入Trizol试剂进行裂解。细胞经Trizol裂解后可直接提取RNA，或在-80℃的冰箱贮存几个月，不影响RNA的产量和质量。

2.组织

新鲜的组织先切成小块（约100mg），立即放入液氮中冻结后，可直接提取RNA或存入-80℃的冰箱保存几个月。RNase含量高的组织，如胰腺、肝脏等可先切成小块后液氮研磨，然后再提取RNA。

3.细胞

收集培养的细胞，重悬于PBS缓冲液洗涤3次，离心收集细胞，加入Trizol试剂裂解细胞，细胞加入Trizol裂解液可直接提取RNA或在-80℃的冰箱储存几个月。

（三）RNA的释放、纯化与浓缩

Trizol试剂pH呈酸性，pH 4.5～5.5，能够始终在破碎和溶解细胞时，能保持RNA的完整性。Trizol的主要成分是苯酚，此外还加入了异硫氰酸胍、8-羟基喹啉、β-巯基乙醇。苯酚起到了裂解细胞的作用，使细胞中的蛋白质、核酸物质解聚释放，但不能完全抑制RNase活性；异硫氰酸胍能够破坏蛋白质的二级结构；β-巯基乙醇能还原RNase的二硫键；8-羟基喹啉与氯仿一起能够有效地抑制内源性RNase活性。核酸分子中的碱基、核苷酸均可发生解离，其中DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5，主要是因为RNA分子中核糖基2′-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。在酸性条件下直接抽提RNA，加入氯仿使蛋白质变性后形成两相，DNA与蛋白质进入有机相，而RNA则留在水相，同时氯仿还可以去除溶解在水中的少量苯酚。通过离心收集水相可将RNA和DNA与蛋白质分离。

收集上清的RNA水溶液，按照Trizol试剂的用量加入0.5倍体积的异丙醇沉淀RNA。异丙醇沉淀RNA比乙醇沉淀可减少多糖和蛋白聚糖的沉淀，提高RNA的纯度，同时也减少多糖和蛋白聚糖对后续RNA操作（如逆转录反应）的抑制效果。最后用75%冷乙醇将RNA沉淀进行洗涤，去除杂质。而处于界面的DNA与蛋白质可通过乙醇和异丙醇分别分级沉淀出来。该法制备的DNA大小为20kb左右，可作RCR反应的模板；蛋白质样品主要用于免疫印迹分析。

四、RNA浓度及纯度的鉴定

由于核酸中的碱基间具有共轭双键，所以具有紫外光吸收的性质。核酸在紫外光谱区有一条非常典型的吸收曲线，吸收的高峰位于260nm处，吸收的低谷位于230nm处。蛋白质在紫外区280nm处具有相应的吸收高峰。A260/A280比值是纯度鉴定的重要指标，纯的RNA A260/A280之比应为2.0；比值＜1.8时，说明溶液中有蛋白质污染；比值＞2.2时，说明RNA已经被水解。

五、RNA的保存

75%冷乙醇洗涤RNA沉淀后，可直接用RNase-free水来溶解RNA，用于后续RT-PCR、引物延伸等实验。RNA长期保存时，可用去离子的甲酰胺溶液溶解RNA，保存于-80℃的冰箱。甲酰胺溶液可以很快溶解纯度比较高的RNA，且可以提供一定的化学环境，抑制RNase降解RNA。甲酰胺溶液溶解RNA可以长期保存，也可以直接用于RT-PCR、RNase保护的实验。用4倍体积无水乙醇溶解的RNA也可长期保存于-80℃的冰箱，因为乙醇在低温下可以抑制所有酶的活性。

六、RNA提取实验方案（Trizol法）

（一）实验器材

细胞，Trizol，氯仿，异丙醇，75%乙醇（无水乙醇∶无RNase水=3∶1，现用现配），无RNase水（nuclease-free water），手套（勤换），枪头（10µL，200µL，1 000µL），枪（100～1 000µL），1.5mL EP管，冰盒，EP管架，冰冻离心机，-80℃冰箱，振荡器。

（二）实验方法

1.细胞准备 贴壁培养的细胞达到1×10⁶个后，弃去培养皿中的培养液，用预温的PBS洗1次，加入1mL Trizol Reagent，静置5～10min，消化吹打使细胞脱落，将细胞悬液移入1.5mL EP管，-80℃冻存备用。

2.加入200µL氯仿（氯仿∶Trizol=1∶5），漩涡器振荡混匀，室温静置10min，12 000rpm、4℃离心15min。

3.轻轻地将上层水相移至新的1.5mL EP管中（用1 000µL的枪吸取），加入500µL异丙醇（与上一步骤加入的1mL Trizol成比例），上下颠倒混匀，室温放置1h或-20℃沉淀过夜，12 000rpm、4℃离心15min。

4.将上清液弃去，加入1mL 75%冷乙醇（用无酶水配制）将RNA沉淀进行洗涤，7 500rpm、4℃离心5min（洗涤时轻弹管壁，并上下颠倒混匀数次）。

5.弃乙醇，将其反扣在吸水纸上干燥，室温放置约15min，让最后残留的少量乙醇挥发（小心将乙醇直接倒入废液缸，将开盖EP管反扣在纱布上）。

6.每管中加入20µL RNase-free Water溶解RNA沉淀，轻轻吹打混匀后，转移至0.6mL的EP管中，置于-80℃冰箱保存（注意不要让RNA沉淀过分干燥，这会降低其溶解度）。

（三）Trizol经典法提取RNA的注意事项

1.全程佩戴一次性手套和口罩，使用高压灭菌的、一次性的EP管和加样枪头，以预防RNA酶污染。

2.Trizol和氯仿均是易挥发有毒液体，操作时避免接触皮肤和衣服，同时应在通风橱中完成操作，避免吸入呼吸道。

3.一些贴壁较好的细胞，加入Trizol后，可适当延长静置时间，以保证将细胞充分洗脱下来。

4.为防止混匀不彻底导致的分层不明显，加氯仿后应保证振荡充分混匀。

5.初次转移上层水相时，尽量用100µL的加样枪，尽可能多地吸取水相层，但应避免吸取到DNA和蛋白质层，以免结果纯度偏低。

6.加入冷乙醇后，轻弹管壁并颠倒混匀即可，尽量不要用加样枪吹吸，以免RNA被不小心带出。

7.反扣在吸水纸上的时间不宜过短或过长。过短，乙醇挥发不充分，影响后续实验；过长，RNA沉淀过分干燥，降低了其溶解度。

（李汉平）