第二节 Ⅰ期临床试验设计的一般考虑
一、总体设计
Ⅰ期临床研究是在人体进行新药研究的起始阶段，是初步的临床药理学及人体安全性评价试验，重点观察人体对新药的耐受程度，探索新药在人体内的吸收、分布、代谢和排泄过程，为后期临床试验制定方案提供依据。Ⅰ期临床试验可以根据临床耐受性试验阶段和临床药动学试验阶段分步设计，也可以不同阶段交叉融合进行复合型研究方案设计。
（一）Ⅰ期临床试验的设计方案类型
合理的临床试验设计是获得有价值的结论的前提。药物临床试验的设计主要分为随机法和设盲法2类。随机法是指将受试者随机纳入某一治疗组别的方法。此法不受研究者主观意志和客观条件的影响，可排除分配误差，有随机数字表和区组随机化2种方法。例如，在12个受试者组成的随机程式中，每6位受试者随机分到相同的治疗药物，但每位受试者被分配到何种药物治疗因无规则可循而无法预测，这种为随机数字表方法。又如12位受试者随机分成2组，每组分别接受相同的一种药物或药物顺序，小样本量的临床试验如双交叉的生物等效性试验多采用这种区组随机化方法。为了避免造成药物相关信息的判断偏差，受试者、研究者、监查员都不应该知道随机编码程式。
设盲法是指参与临床试验的受试者、研究者、监查员、统计师中的一方或多方不知道受试者治疗分配的程序或方法，包括单盲法、双盲法、双盲双模拟等设盲法。设盲手段通过使治疗组别和药物从外表特征上无法判断它们之间的区别而实现。单盲法是一种规定受试者不知道，但研究者知道治疗分配程序的试验方法。例如，试验制剂与对照制剂的外观不完全一致，对研究者无法设盲，但使受试者不知道何为试验制剂、何为对照制剂。单盲法的优点是能消除受试者心理因素的主观影响，相对客观地反映药物的疗效和安全性。但实际工作中参与评价药物疗效和安全性的医务人员往往就是研究者本人，研究者对药物作用评估的主观偏向仍然存在，如研究需要，方案设计时也应考虑对评估人员的设盲。双盲法是指临床试验中的受试者、研究者、参与疗效和安全性评价的医护人员、监查员、数据管理人员及统计分析人员都不知道治疗程序的分配，优点是能将偏倚降低至最低限度，能避免为了获得所期望的试验结果而有选择性地收集试验数据。双盲法实施的前提是申办方提供的试验制剂和对照制剂的外观、颜色、大小与气味等均无区别。首次用于人体新药的Ⅰ期临床试验，在耐受性剂量爬坡阶段，为甄别试验药物的安全性事件，每个剂量组常采用安慰剂对照的双盲法设计。
在Ⅰ期药物临床试验研究中，当研究针对治疗机制或临床药理学终点且是客观指标时，选择偏倚一般可以有效避免，随机方法在这类研究中的作用不大。但剂量确定试验由于涉及剂量的升降规则，需要选择合理的随机设计方法，包括平行对照法、成组序贯设计、交叉设计、析因设计等。
1.平行对照法是一种全随机式设计。每位符合试验入组标准的受试者随机地只给予1种治疗药物或者对照物。平行对照法又分为分组对照法（或平行比较法）和配对平行法。在分组对照中，又可分为安慰剂对照、空白对照、剂量对照、阳性药对照和外部对照5种。分组对照法主要用来进行观察，常用于探索性和确证性临床试验。配对平行法的受试者被分成两大组，每组为一整体，每组被集体地随机划分至对照组或者治疗组。在Ⅰ期药物临床试验研究中，分组对照法常用于不同剂量组药物的耐受性试验和药动学试验设计，以比较暴露剂量的不同是否导致安全性事件在类型和程度上存在差异，以及体内过程是否表现出线性动力学特征。分组对照法也用于长半衰期药物的生物等效性评价的方案设计。
2.成组序贯设计指将试验组与对照组按相同的比例分成数个批次，每批受试者完成方案规定的试验后，即将该批次揭盲并对主要指标（包括有效性和安全性）进行分析，以确定试验是否继续进行。一旦产生结论（不管有无统计学意义）即停止整个试验，试验批次应＜5次，各批次的盲底应一次性产生。成组序贯设计可避免盲目加大样本量而造成浪费，但又不至于因样本量过小而得不到应有的结论，常用于大型、观察期较长或事先不能确定样本量的临床试验。Ⅰ期药物临床试验在不同剂量组递增的耐受性试验中，可以应用定量药理学的模型提高成组序贯设计目标的可预测性和准确性。
3.交叉设计为修正随机化分组，其中每个分组接受1种以上的治疗剂量药物。各组别可以是1位受试者，也可以是1组受试者。常见的交叉法有2×2式（AA、BB、AB、BA），用于比较受试者自身的效应。由于每个受试者对每种治疗药物都被重复服用，因而可以观察受试者个体对药物疗效的差异。2×3式（ABB、BAA）中第2周期与第3周期服用的药物相同，所以也称为延长周期设计法或部分重复设计法。2×4式（AABB、BBAA）可视为双重标准2×2式（AB、BA）交叉设计法，也称为复式设计法，这2种交叉设计法常被用于高变异药物的生物等效性评价。4×2式（AABB、BBAA、ABBA、BAAB）是一种选择型四系列四周期二治疗组的交叉设计法，它是由2对双重系列（AABB、BBAA）和（ABBA、BAAB）组成的。
4.析因设计是一种多因素的交叉分组试验方法，通过对处理因素的不同组合，可以对2个或更多的处理因素同时进行评价，适用于多个药物采用不同剂量（水平）组合的临床试验评价，在新药复方制剂的Ⅰ期临床试验设计中可以考虑采用。根据全部组合的观察数据，使用反应曲面的方法有助于确定各个药物最合适的剂量组合。
（二）Ⅰ期临床耐受性试验设计的总体思路
Ⅰ期临床耐受性试验大多选择健康受试者，由于健康受试者本身没有任何疾病，他们并没有受益于服药干预，因此保护受试者的安全性极其重要。Ⅰ期临床耐受性试验的新药大多在人体内首次使用，因此一般都从非常低的剂量开始，采用平行递增法。即受试者仅参与一个剂量组或对照组的试验，当剂量调整到另一剂量时，即使试验药物在此受试者体内已全部或大部分排空，此受试者也不能参与该临床试验的另一剂量组试验。某些耐受性试验也可以采用交叉递增法，这一方法的优点是所需的受试者少且可以减少个体间差异。平行和交叉递增剂量法都包括单次给药剂量递增法和多次给药剂量递增法。但无论使用哪种试验设计方法，耐受性试验设计的首要原则之一都要确认人体试验的安全起始剂量。
根据国家食品药品监督管理局于2012年发布的《健康成年志愿者首次临床试验药物最大推荐起始剂量的估算指导原则》，起始剂量的计算有5个步骤。第一步：敏感动物未见明显毒性反应剂量（NOAEL）的确定；第二步：人体等效剂量的计算（根据体表面积换算、使用mg/kg换算，不同动物种属间不按mg/m2换算的其他例外）；第三步：最适合动物种属的选择；第四步：安全系数的使用（增大安全系数或降低安全系数）；第五步：药理学活性剂量的考虑。起始剂量过低，需多次剂量递增才能到达最大耐受剂量，这样需要较长的试验时间和较多的研究经费；起始剂量过高，则风险增大，有可能起始剂量即引起较严重的毒副作用。合适的起始剂量应当避免毒性反应，但又能经剂量递增快速达到Ⅰ期药物耐受性的目标剂量。在确定起始剂量时，应当考虑所有相关的临床前数据，包括化合物的药理活性剂量、完整的毒理学特点以及药物的药动学信息。
对于非细胞毒性药物，人体耐受性试验的起始剂量可以参考采用大鼠、狗或猴无毒副作用剂量的1/10。对于毒副作用大的药物，起始剂量应小于1/10的NOAEL；对于较安全的药物，起始剂量可适当大于1/10的NOAEL。如果起始剂量远低于NOAEL且毒副作用较小，剂量可以较快的速度递增；否则应缓慢递增。此外，初始的几次剂量组可以递增较快，但当剂量上升到一定水平后，后续剂量组则应缓慢渐增。例如，改良的Fibonacci递增法的剂量递增幅度通常为100%、67%、50%、40%和30%～35%。当然，具体使用何种递增方法还是要根据化合物的特性考虑。试验药物通常递增至出现毒性（一般为当某一剂量组50%以上的受试者出现不良反应或1例以上有严重不良反应）停止，这个剂量称为最低非耐受剂量，该剂量的前一个剂量称为最大耐受剂量（MTD）。有些药物的毒副作用非常低，最大耐受剂量不一定能得到，根据试验设计只能递增到一定的剂量水平后即终止试验。这个剂量称为最高可给予剂量，将来临床应用时原则上不能超过这一最高剂量。
耐受性试验旨在为后续的人体试验确定安全的剂量范围。由于每种药物的分子结构不同，所以具有不同的理化和生物学特性，表现为不同的安全性考量，研究者需要对受试药物全面综合认知后，才能设计出安全、合理的研究方案。
（三）Ⅰ期临床药动学试验设计的总体思路
通常Ⅰ期临床耐受性试验后即进入药动学研究，目的是探讨药物在体内吸收、分布和消除（代谢和排泄）的动态变化特点以获得该药物在人体中的药动学参数。药动学试验通常采用随机、开放、交叉或平行试验设计，涉及单次和多次给药的药动学研究。一般选用低、中、高3种剂量，剂量的确定主要根据Ⅰ期临床耐受性试验的结果，并参考动物药效学、毒理学试验的结果。高剂量组剂量必须接近或等于人体最大耐受剂量。采样点的设置对药动学研究结果具有重大影响，可根据动物实验的结果和参考同类药物的文献来设计采样点的分布，也可通过进行人体预试验而确定。一般在服药后抽取12～20个取血点。如果是多次给药试验，除在第1天服药后抽取密集的血样外，还会根据药物的半衰期设计采集几个谷浓度的血样，以确定给药后是否达到稳态血药浓度；然后采集最后一次服药后的密集血样，以模拟稳态血药浓度后的血药浓度-时间曲线。一条完整的血药浓度-时间曲线应覆盖各时相的采样点，通常包括用药前的空白血液样本，给药后的吸收相、药峰浓度附近、分布相和消除相的采样点。一般在吸收相至少需要2～3个采样点，药峰浓度附近至少需要3个采样点，分布相和消除相至少需要3～5个采样点，总共不少于11～12个采样点。采样终点需持续3～5个消除半衰期的时间，或其血药浓度降低至C max的1/20～1/10。
试验方案还需设计选择合适的检测血药浓度的分析方法，以及根据测得的受试者的血药浓度-时间数据绘制各受试者的血药浓度-时间曲线及平均血药浓度-时间曲线；同时选择进行药动学参数估算的药动学软件，设定药物的哪些主要药动学参数作为研究终点的判定指标。研究还需根据试验目的设计研究的终点，如受试新药的药动学特征、是否呈线性或非线性动力学特征、多次给药较单次给药的暴露是否呈现蓄积效应等，为后续的临床试验、临床合理用药及治疗药物监测提供有价值的信息。
（四）Ⅰ期临床药动学试验初步药效学探索设计的总体思路
新药Ⅰ期临床试验的初步药效学评价是探索性的研究目标，通常选择适应证患者为受试者（充分考虑伦理有利的原则），旨在为后期临床试验的药效学评价和验证的终点评价指标确定提供早期的药效趋势和证据，也可探索性筛选如生物标志物等替代终点评价指标。研究设计的重点考虑应基于受试新药的作用机制和靶点，选择敏感的临床和生物学效应指标进行初步探索。另一考虑因素是探索药效学评价的时间终点，以抗肿瘤新药的初步药效学评价为例，常常与耐受性试验和药动学评价进行融合设计，以影像学指标的稳定和改善作为评价时间终点选择的依据（连续给药通常持续至少28天）。就某些有效性评价指标和安全性评价指标在研究进程中可能转换的新药，设计时更要关注药动学曲线和药效学曲线变化的差异，探索其内在规律。因此，以适应证患者为受试者开展耐受性试验、药动学评价和初步药效学探索的融合设计Ⅰ期临床试验已越来越成为新药早期临床评价设计的共识。
二、受试人群选择
Ⅰ期临床试验受试人群应根据研究目的和药物安全性类别进行选择。根据Ⅰ期临床试验各个研究阶段的科学目的和受试者风险暴露程度及范围，兼顾科学性和伦理性统筹考虑受试者样本量。
（一）受试人群选择的基本要素
Ⅰ期临床试验选用健康志愿者或特定患者作为受试者，视具体药物而定，没有统一的模式，多数新药可以选择健康受试者人群。但如果某些新药的安全性较小，试验过程中可能对受试者造成伤害，出于伦理的考量不允许在健康志愿者中进行试验时，可选用目标适应证患者作为受试者，并且在试验期间应保证患者病情稳定。
Ⅰ期临床试验选择受试人群还应考虑到研究的阶段性和适应证，以及已有的非临床和临床试验背景。在早期试验中受试者的组群变异可以用严格的筛选标准选择相对同质的受试者，但当试验向前推进时，应扩大受试人群以反映目标人群的治疗效果。根据研发进程和对安全性的关注程度，某些试验需要在严密监控的环境中（如住院）进行。除极个别的情况外，受试者不应同时参加2个或2个以上的临床试验。如果没有充分的时间间隔，受试者不应重复进入临床试验，以确保安全性和避免延滞效应。育龄妇女在参加临床试验时通常应采用有效的避孕措施。对于男性志愿者，应考虑试验中的药物暴露对其性伴侣或后代的危害。当危害存在时（例如，试验涉及有诱变效力或有生殖系统毒性的药物），试验应提供合适的避孕措施。
与普通人群相比，特殊人群的获益/风险比可能有所不同，或者预计需要调整给药剂量或给药时间，对此种特殊人群应进行专门的临床试验。例如：
（1）在孕妇中的研究：
如果研究药物不计划用于妊娠期，孕妇应被排除在研究之外。如果患者在临床试验期间怀孕，一般应终止试验，及时报伦理委员会备案，并对孕妇、胎儿和儿童进行随访评价。同样，计划用于妊娠期的药物临床研究涉及孕妇，孕妇、胎儿和儿童的随访评价也非常重要。
（2）在哺乳期妇女中的研究：
如果可行，应检测药物或其代谢产物在人乳中的分泌。如果哺乳期妇女被招募进入临床试验，应同时监测药物对其婴儿的影响；如果必要，并对该儿童进行随访。
（3）在儿童中的研究：
需要进行的研究内容取决于现有的对药物的认知，以及由成人和其他年龄组儿童外推的可能性。某些药物可能在早期研发阶段就用于儿童。对于期望用于儿童的药物，应在适宜的儿童年龄组进行评价。如果临床试验涉及儿童，应从高年龄组开始，然后再扩展至低年龄组。
（4）在老年人中的研究：
在西方国家，65岁以上称为老年人，有时老年患者的起始年龄可定位在60岁。一般老年人易受多种因素影响，且老年患者常同时服用多种药物，需考虑药物-药物相互作用。老年人与成年人相比，最显著的不同在于心、肝、肾以及肠胃道吸收功能的衰退。由于心脏功能减弱，常会引起用药后对心脏的不良反应，如Q-T间期延长，使得患者易猝死。由于肝肾功能减弱，老年人在使用药物时不易代谢解毒并清除出体外，使得血药浓度高于一般成年人；而肠胃道吸收功能降低则可能导致血药浓度达不到预期的治疗要求。以上种种由于高年龄和器官组织功能的衰退，会对某种药物在老年人中的血药浓度带来影响，因而针对老年人的药物在相应的人群中进行研究很有必要。
（二）健康志愿受试者的选择
当药物处于Ⅰ期临床试验研究时，EMA认为在大多数情况下健康志愿者体内模型足以检测制剂的差别，可以说明药物在人体内的吸收、分布、代谢和排泄规律。因为当身体有相关的疾病问题时，如酒精性肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎、肝硬化、肾功能不全等，有可能会改变某些药物在体内的行为。
例如，肝脏与大多数药物的清除相关，这些药物通过多种氧化和结合代谢途径并且/或者通过胆汁排泄，以原型药或者代谢产物的形式得到清除。肝功能不全可以导致这些排泄和代谢活动的变化而造成药物积累，或在少数情况下无法形成活性代谢产物。肝功能不全、肝脏疾病可以改变药物的吸收和分布，进而改变药物的有效性和安全性。即便肝脏并不是某药物的主要消除器官，肝脏疾病也可能会改变肾脏功能，从而导致药物及其代谢物积累。
又如，当药物进入体内后，通过排泄或者代谢排出体外。尽管排泄可以通过多种途径中的任意一种，但是多数药物以原型药的形式通过肾脏和/或肝脏排出体外。对于仅仅通过肾脏排泄机制消除的药物，肾功能不全可能会导致其药动学性质或者药效学性质改变。虽然在肾功能不全患者中观察到的大多数变化类型为药物或者其活性产物经肾脏排泄或者肾脏代谢减小，但是肾功能不全与其他变化存在关联，如吸收、肝脏代谢、血浆蛋白结合及药物分布的变化。
根据国家食品药品监督管理局药品审评中心于2005年颁布的《化学药物临床药代动力学研究技术指导原则》，研究设计时应考虑健康受试者经过全面体检，身体健康，无心、肝、肾、消化道、神经系统、精神异常及代谢异常等病史；体格检查显示血压、心率、心电图、呼吸状况、肝肾功能和血象无异常，避免药物的体内过程受到疾病干扰；同时应该检查输血九项；根据药物类别和安全性情况，还应在试验前、试验期间和试验后进行特殊项目检查，如降血糖药应检查血糖水平。
国家食品药品监督管理总局药品审评中心于2015年11月发布的《以药动学参数为终点评价指标的化学药物仿制药人体生物等效性研究技术指导原则》明确指出，受试者的选择一般应符合以下要求：①年龄在18岁以上（含18岁）；②应涵盖一般人群的特征，包括年龄、性别等；③如果研究药物拟用于2种性别的人群，一般情况下研究入选的受试者应有适当的性别比例；④如果研究药物主要拟用于老年人群，应尽可能多地入选60岁以上的受试者；⑤入选的受试者例数应使生物等效性评价具有足够的统计学效力。以上受试者人群的一般选择原则也同样适用于药动学比较研究、生物制剂类似物的桥接药动学研究等类型的Ⅰ期临床试验设计。
（三）适应证患者受试者的选择
与患者相比，健康受试者通常更容易招募。健康受试者不服用其他治疗药物，对试验药物的反应更趋于一致，耐受性更佳，容易完成长周期或复杂性试验。但是某些新药，例如，细胞毒性抗肿瘤药和绝大多数基因治疗类药物，蛋白、单克隆抗体、基因修饰的生物制剂则属例外，必须选择有目标疾病的患者为试验对象；肝肾功能不同程度受损的药动学观察也使用特定的患者作为受试者。
例如，当肝功能不全患者的肝脏代谢和/或排泄的药物或者活性代谢产物占原型药或者活性代谢产物排泄量的较大部分（＞吸收药物的20%）时，或虽然该药物和/或活性代谢产物的肝脏消除部分为次要部分（＜吸收药物的20%），但药品说明书内容或者文献调研显示该药物为有效药物浓度范围狭窄的药物时，都应该选择相应的肝功能不全患者。正如血清肌酐或者肌酐清除率可以用于对肾脏损伤的不同程度进行分类一样，FDA推荐采用Child-Pugh分类法对肝功能不全程度进行分类，从而选择合适的患者。一般来说，包括对照个体和按照Child-Pugh分类级别为中度级别患者的研究设计比较适宜。目的是根据肝脏功能正常患者中药物的具体情况，判断肝功能不全患者体内的药物及其代谢产物的PK和/或PD是否会发生变化，以帮助指导给药剂量是否需要调整。因此，对照组人群需从目标治疗患者（肝功能正常）中选取，而不能从年轻的健康志愿者中选取。在可能的情况下，在年龄、体重和性别方面，对照组人群需要与患者相似。依据药物的不同，还应考虑其他可能显著影响所研究药物的PK的因素（如饮食，吸烟、饮酒、伴随给药、种族）。如果进行研究的患者需要进行伴随给药，在数据分析期间，需要根据其对PK或者PD的影响进行慎重评估。对于存在遗传多态性的酶（如CYP450、2D6、2C19）介导代谢的药物，在分析研究结果时需要考虑入选的受试个体的代谢状况。
又如肾功能不全可能会显著改变药物和/或其活性/毒性代谢产物的PK且需要进行给药剂量调整，出于对这类患者安全性和有效性的考虑，该类药物的临床试验建议在肾功能不全患者中进行PK研究。当药物或其活性代谢产物的治疗系数狭窄并且仅仅通过肾脏排泄或者代谢时，建议在肾功能不全患者中进行研究。当药物或者其活性代谢产物的代谢同时需要较高的肝清除率和显著的血浆蛋白结合时，也应当考虑进行该研究。在这些情况下，由于血浆蛋白结合减少以及总清除率变化较小或者无变化的情况（未结合药物的清除率低），胃肠外给药在肾功能不全患者中可以诱导未结合（游离）药物的量增加。肾功能对照组必须优先选择就某药物而言有代表性的典型患者群体。尤其重要的是，如果典型患者群体由老年人包括妇女组成，则不应该包括健康的年轻男性志愿者。由于肾脏功能的范围较宽，可以增强检测和表征肾脏功能对PK影响的能力。为了确保能够完全代表不同级别的肾功能不全患者，建议按肌酐清除率进行肾功能不全分级，每个级别中筛选大约相同数量的患者作为受试者。
出于对健康受试者安全性的考量，Ⅰ期临床试验也会选择适应证患者来实施对受试者预期会造成较大伤害的药物的临床试验，如抗肿瘤药、某些神经精神类等新药的Ⅰ期临床试验。以适应证患者为受试对象开展的Ⅰ期临床试验，由于首次用于人体试验的新药的疗效具有不确定性，受试者纳入标准通常会选择经过临床标准治疗失败的患者。这导致Ⅰ期临床试验设计时必须特别考量受试者难以获得的状况，如采用“3+3剂量递增”设计，以及耐受性试验与药动学试验，乃至初步药效学探索性试验相互融合的设计，这些共识也已成为目前国内外Ⅰ期临床试验研究设计的趋势。
（四）受试人群的样本量确定原则
Ⅰ期临床试验受试人群样本量的确定具有不确定性，这是由创新药首次用于人体试验的不可预知性决定的。所以，受试人群的样本量往往因药物的作用机制、生物学效应的类型和程度、动物实验的安全性剂量范围不同等而异。
一般而言，耐受性试验设计时考虑的原则是起始剂量组的例数较少（“哨兵探索剂量”，甚至仅有1例受试者）；到达由动物实验推算的人体有效剂量范围时，样本量应尽量接近具有统计学趋势要求的例数；到达不良事件发生率较高和严重不良事件或非预期严重不良反应发生的剂量范围时，受试者例数应适当减少，以保护受试者免受严重伤害。为甄别与药物相关的不良事件或严重不良事件，每组受试者按比例设计服用安慰剂已成为惯例。药动学研究设计时考虑的原则是各剂量组的受试者样本量尽量满足差异比较具有统计学趋势的要求，2～3个剂量组应尽量覆盖可能的临床应用剂量范围，一般为8～12例/组。药效学探索性试验可以在Ⅰb或Ⅰc期开展，其样本量的设计因药而异、因是否设计拓展性剂量组而异。目前某些案例设计的总例数接近于Ⅱ期临床试验的样本量，表现出直接桥接过渡到Ⅲ期验证临床试验的趋势。
以Ⅰ期临床试验药动学研究数据为基础的生物等效性研究的样本量设计原则在《以药动学参数为终点评价指标的化学药物仿制药人体生物等效性研究技术指导原则》（征求意见稿）中有概括的表述，可供研究方案设计时参考。
三、研究终点及评价指标
Ⅰ期临床试验的研究终点和评价指标是基于药动学特征、安全性评估和药物的量效与风险暴露的关系来确定的。
研究指标包括指标的属性（定性、定量、半定量）及其具体观察方法。药物临床试验的研究终点是用于评价与药动学参数、药效学测定、药物有效性和安全性等药物作用有关的研究指标。主要终点根据研究的主要目的选择；次要终点用于评价药物的其他特性作用，可以与主要终点相关或不相关。研究终点及其判定标准应在研究方案中预先阐明。
替代终点是与临床终点相关的指标，但其本身并不是临床获益的直接证据。仅当替代终点极可能或已知可以合理地预测临床终点时，替代终点才可以作为主要指标。用于评价临床终点的方法无论是主观的或是客观的，其准确度、精确度及响应性（随时间变化的灵敏度）应是公认的。在终点指标的测量不可行的情况下（如需要很长时间），就需要采用替代指标来评估干预措施的效果。替代指标一般易于测量，如常用的生物标志物。生物标志物指的是被认为与正常生理过程或病理生理过程的某些方面有关的生理学、病理学或解剖学测量指标，这些生物标志物包括提示疾病病因、疾病易感性或疾病过程的测量指标。根据与治疗效应或临床获益终点的关系密切程度不同，血压、胆固醇、病毒负荷等被认为是临床获益的有效的替代指标；阿尔茨海默病的脑部特征、脑梗死面积、各种放射影像/同位素功能试验被认为是反映病理过程且至少是候选替代指标的生物标志物；ADP依赖的血小板聚集抑制、ACE抑制等是可反映药物作用，但与临床转归关系不明的生物标志物；而受体结合的程度或激动剂的抑制是与临床获益终点关系更小的生物标志物。
采用替代指标必须有足够的证据支持其与临床终点结局的关系，并可预测疾病结局。其应用的前提是替代指标的改善也将会相应改善疾病的终点结局。替代指标选择不当有可能导致错误估计干预对临床最终结局的作用。例如，为了减少心肌梗死患者发生心律失常而应用抗心律失常药的结果反而会导致病死率增加。
（一）基于安全性评估确定研究终点和评价指标
一般药物的Ⅰ期临床耐受性试验可能不评价疗效，而仅评价安全性。主要终点指标可能是不良事件，血尿常规、血生化等实验室检查，12导联心电图，生命体征，体格检查等。此时主要终点指标就不是主要疗效指标而是安全性指标，常根据试验药物的特征来制定研究终点和评价指标。设计时多参考美国国家癌症研究所（NCI）常见不良反应事件评价标准（common terminology criteria for adverse events，CTCAE 5.0），按系统器官分成26类，如血液和淋巴系统疾病、心血管系统疾病、肝胆疾病、胃肠道疾病等确定安全性终点指标。例如，任何达3级的非血液学毒性；经过治疗后的3级腹泻、恶心或呕吐；任何达4级的毒性；有明显胸闷、心悸、呼吸困难的临床症状且心电图检查异常并有临床意义，Q-T间期＞480毫秒，LVEF下降及心肌酶谱检查异常、BNP检查高于正常值，心脏不良事件分级2级以上即可判断心脏毒性；这些都可以考虑设计为剂量限制性毒性（DLT）的研究终点。常见的以剂量限制性毒性作为研究终点的安全性指标有：①中性粒细胞减少，毒性程度4度（＜0.5×109个/L），毒性持续3～7天；②血小板减少3度（＜25×109个/L）；③肝脏3度GOT或GPT；④任何非血液性毒性3度或4度。除剂量限制性毒性的程度外，DLT发生的时间段也可以在设计时预先加以确定。例如，对于静脉注射和起效快的试验药物，只有在用药后4周内发生的毒性才定义为剂量限制性毒性；而对于某些长期服用的试验药物，其毒副作用的观察期可为4～8周。
某些毒性较大的药物如抗肿瘤药，选择的受试者一般为相应的患者。除安全性指标外也会设计相应的有效性评价指标，通常包括临床状况评价和实验室检测指标。观察指标的选择应遵守4个原则：①关联性，即指标是否能最好地说明和反映试验目的；②普遍性，即能否在所有受试者中均能观察其变化；③真实性，即能灵敏、无偏倚地反映所要观察的病理生理现象；④受试者和实际操作研究人员是否乐意接受。将试验观察指标与标本采集次数、时间和结果记录方式制作成流程图附于试验方案，以便统计学分析。目前，有效性评价一般采用4级评定标准：①痊愈，即症状、体征、实验室检查与专业特异性指标均为正常；②显效，即以上4个方面之一未恢复正常；③有效，即以上2个方面未恢复正常；④无效，即1个疗程后无变化或恶化。有效率则以痊愈+显效的病例数进行统计。
Ⅰ期临床试验方案设计中应明确规定研究者必须对试验过程中所发生的不良事件进行仔细观察、如实记录和科学评估，及时判断不良事件是否与试验药物有关并对其进行说明。所有不良事件不管与试验药物有无关系，均应及时采取有针对性的医疗措施，以充分保障受试者的权益。此外，还必须规定研究者将Ⅰ期临床试验发生的严重不良事件以及非预期的严重不良反应立即报告给申办方、临床试验机构和伦理委员会，申办方在综合评估研究风险和受试者安全性的基础上，在《药物临床试验质量管理规范》（GCP）界定的期限内向国家药品监督管理局报告。
（二）基于生物药剂学和药动学特征确定研究终点和评价指标
生物药剂学是研究药物及其剂型在体内的吸收、分布、代谢和排泄过程，阐明药物的剂型因素、机体的生物因素和药物疗效之间的相互关系的学科。生物药剂学主要是研究药理上已证明有效的药物当制成某种剂型以某种途径给药后能否很好地吸收，从而及时分布到体内所需作用的组织及器官（或称靶器官、靶组织）。药动学（PK）是应用动力学原理与数学模型方法，定量描述药物在体内的动态变化规律的学科。药物通过各种途径进入体内，其ADME过程均存在“量时”变化或“血药浓度经时”变化，对这一动态变化过程的规律进行定量描述即为药动学。
以药动学参数为Ⅰ期临床试验的终点评价指标可表述为根据试验中测得的各受试者的血药浓度-时间数据绘制各受试者的血药浓度-时间曲线及平均血药浓度-时间曲线，进行药动学参数的估算，求得药物的主要药动学参数，以全面反映药物在人体内的吸收、分布和消除特点。暴露量是指给药（药物输入人体内）后的血浆或其他体液中的药物浓度测量结果，如C max、AUC等。当指定的给药剂量与血药浓度的相关性较好时，根据人体耐受性试验的结果并参考动物药效学、药动学及毒理学试验的结果，确定3个剂量进行药动学研究。每个剂量的暴露量通过测定受试者在服用该剂量后，采集不同时间点包括给药后的吸收相、药峰浓度附近和消除相的静脉血，测得血药浓度，将剂量和暴露量相关联。通过不同的给药方案和所得的暴露量建立药物在人体中的药动学模型，获得药动学评价指标和药物暴露终点指标。一般而言，单次给药研究通常采用药动学终点指标，如达峰时间（t max，实测值）、药峰浓度（C max，实测值）、血药浓度-时间曲线下面积（AUC0～t和 AUC0～∞）、表观分布容积（V d）、消除速率常数k el、消除半衰期（t1/2）、平均滞留时间（MRT）、清除率（Cl或Cl/F）等进行评价。
当研究药物将在临床上连续多次应用时，方案设计需明确多次给药的药动学特征。根据研究目的，应考察药物多次给药后的稳态血药浓度（C ss），药物谷、峰浓度的波动系数（DF），是否存在药物蓄积作用和/或药酶的诱导作用。根据试验中测定的3次谷浓度及稳态血药浓度-时间数据，绘制多次给药后的血药浓度-时间曲线，求得相应的药动学参数，包括达峰时间（t max）、稳态谷浓度（C ss_min）、稳态峰浓度（C ss_max）、平均稳态血药浓度（C ss_av）、消除半衰期（t1/2）、清除率（Cl或 Cl/F）、稳态血药浓度-时间曲线下面积（AUCss）及波动系数（DF）等，选择其中的特定参数作为终点判定指标。对试验结果的分析应该明确说明多次给药时药物在体内的药动学特征，同时应与单剂量给药的相应药动学参数进行比较，观察它们之间是否存在明显差异，特别在吸收和消除等方面是否有显著改变，并对药物的蓄积作用进行评价，提出用药建议。
Ⅰ期临床试验中也会考察制剂是否存在非预期的药动学差异，以证明其安全性和疗效。设计的验证方法通常采用体外和/或体内生物等效性试验以说明新剂型的性能与已验证过主要疗效数据和安全性数据的参比剂型比较是否具有等效性。对于大多数药物而言，生物等效性研究着重考察药物自制剂释放进入体循环的过程，一般设计在相似的试验条件下单次或多次给予相同剂量的试验药物后，将受试制剂中药物的吸收速率和吸收程度即暴露情况（如C max、AUC）与参比制剂的差异进行比较。通常推荐采用单次给药的药动学研究方法评价生物等效性，因为单次给药在评价药物释放的速度和程度方面比多次给药的稳态药动学研究方法更敏感，更易发现制剂释药行为的差异。若出于安全性考虑，需入选正在进行药物治疗且治疗不可间断的患者时，可在多次给药达稳态后进行生物等效性研究。建议采用如下2个参数作为终点指标评价吸收程度：①从0时到最后一个浓度可准确测定的样本采集时间t的血药浓度-时间曲线下面积（AUC0～t）；②从0时到无限时间（∞）的血药浓度-时间曲线下面积（AUC0～∞ ）。 AUC0～∞=AUC0～t+Ct/λz。 其中，Ct代表最后一个可准确测定的药物浓度，λz代表用适当的方法计算所得的末端消除速率常数。对于多次给药研究，建议采用达稳态后给药间隔期（τ）内的血药浓度-时间曲线下面积（AUC0～τ）评价吸收程度。试验制剂与参比制剂相比，AUC0～t、AUC0～∞、C max（稳态研究提供 AUC0～τ、C ss_max）几何平均值、算术平均值、几何平均值比的90%置信区间（CI）应为80.00%～125.00%。
（三）基于药物的量效与风险暴露的关系确定研究终点和评价指标
在Ⅰ期临床研究中除安全性评估和PK暴露特征评价研究终点外，也可基于药物的量效与风险暴露的关系来确定研究终点。效应是指对药物的药理学影响的直接测量结果。药物的疗效和安全性影响都能用多种测量指标或效应终点表现，这些效应包括临床结果（临床获益或毒性）、对十分明确的替代指标（血压、脂类变化或Q-T间期变化）的影响，以及对关系更小的被认为与临床效应有关的生物标志物（ACE抑制的变化或缓激肽水平的变化）的影响。具体的药物应根据相应的反映药物效应的指标来确定评价指标。一般多个效应终点比单个效应终点提供的信息量更大，特别是临床上较少具有说服力的终点（生物标志物、替代指标）。
暴露量-效应信息是确定所有药物的疗效和安全性的核心关键。即只有在明确了解一个药物的获益和不良反应与该药物暴露的相互关系时，才能够确认该药物是安全和有效的。某些情况下，那些耐受性非常好且剂量相关性毒性很低的药物，其单剂量给药在暴露量-效应关系曲线的坪浓度范围内是安全和有效的，且不用调整药动学特点或不会对患者个体产生其他影响。然而，在大多数情况下，对于多数毒性较大的药物而言，药物的临床用量建立于对特定给药剂量下的药物有利和不利影响的权衡。对于这类药物，在某些时候可将给药剂量递增至有效剂量或耐受剂量，根据有利和不利的暴露量-效应关系来确定药物的研究终点，以避免出现某些非预期和未认知的剂量相关性毒性。有些药物在增加暴露量后临床效应不便观察或变化缓慢、观察时间很长，也可采用短期生物标志物或替代终点获得暴露量-效应数据。如果能够证实在一次特定给药或血药浓度增加后的短期效应并不增加，则没有理由在临床试验中去探索更高的给药剂量或血药浓度。
当药动学存在很大程度的个体间差异，或者给药剂量与血浆药物浓度之间存在非线性关系时，剂量与血浆药物浓度的相关性较差，浓度-效应关系混淆不清，可用暴露量-效应关系来确定终点指标控制风险。因为当药物原型和代谢产物均有活性时，不同的暴露测量结果（如C max、AUC）会给出不同的暴露量或安全性之间的相互关系，剂量对应的效应具有高度可变性。
某些生物等效性研究不能使用标准的90%CI落在80.00%～125.00%之间的评价标准，但是浓度检测中其暴露量确实存在差异，但这种差异在临床上并不重要，可以用暴露量-效应的数据来说明这种差异在临床上疗效相等且同样不存在临床风险。这样，不用改变产品剂型，也不用重复生物等效性研究，也许就能够支持“使用一个较宽的置信区间或接受一个确实存在的生物利用度差异或暴露量差异而不会造成治疗差异”这个观点。
对于生物制剂药物，制造过程的改变常常会不经意地使产品发生微小的变化，导致药动学发生变化，这种情况下暴露量-效应可能提示产品的变化是否会产生药理学影响（如对期望的免疫原性是否有影响）。如果制剂变化或制造过程的改变使药动学发生改变，那么所测得的暴露量-效应数据就可以反映效应与相应的临床结果之间的关系，因此可以考虑作为研究终点的评价指标。
四、生物样本采集及检测
Ⅰ期临床试验根据试验目的的不同采集不同类型的生物样本。依据国家法规和技术指导原则的要求对生物样本采集、处理和检测应能溯源。生物样本检测结果对科学目的和终点评价指标意义重大。
（一）生物样本的类型及其对Ⅰ期临床试验研究的意义
Ⅰ期临床试验的目的是在健康志愿者或适应证患者中研究人体对药物的耐受程度，并通过药动学研究了解药物在人体内的吸收、分布、消除规律，为Ⅱ期临床试验提供安全有效的、合理的试验方案。研究实施中采集生物样本的过程及其质量控制、测定结果的准确性和可重复性对研究结局至关重要。
Ⅰ期临床试验的生物样本类型包括血液、血浆、血清、粪便、尿液、汗液、脑脊液、唾液、痰、眼泪、毛发等。以药动学参数为终点评价指标的Ⅰ期临床试验药动学和生物等效性研究又可表述为通过测定可获得的生物基质（如血液、血浆、血清、粪便、尿液等）中的药物浓度，取得药动学参数作为终点指标，以此反映药物释放并被吸收进入体循环的吸收、分布、代谢和排泄规律。
（二）生物样本采集和记录的一般原则
生物样本的生命周期分为2个阶段，第一阶段为样本采集、前处理、短期储存和检测；第二阶段为样本检测完成后的长期储存（最长储存时间或许至药物批准上市后）。在样本生命周期中的记录就像树的年轮一样，真实刻录着样本生命中的每一阶段和每一重要时刻（如采集、前处理、入库冻存、出库、回库、整个生命周期的温度记录等），研究设计对这些过程和关键要素的严谨界定起重要的保证作用。
1.建立样本采集标准操作规程
药物临床试验的全球化发展意味着一个临床试验项目的不同研究程序有可能会在不同的地方采集样本，在不同的地方保存，由不同的实验室检测。符合规范要求的样本采集、处理、储存极其重要，是获得优质数据的前提。尽管有的样本问题即时就能被发现，如溶血、脂血，而有的样本问题却要在样本测定后由于数据明显异常或留样再测（ISR）不合格时才能被发现。这些问题往往需要进一步研究，可能会导致方案的重新设计，一些重复确证的验证还有可能导致整个项目进度的推迟。因此，除通用的生物样本采集准则外，研究方案设计有必要根据试验药物和制剂的特点，在样本采集前建立一个规范化的样本采集标准操作规程（standard operation procedure，SOP）。
2.采集生物样本前应考虑的影响样本质量的因素
影响生物样本质量的因素较多，下面以常用的血液样本采集为例分析影响因素。
（1）临床采血的某些操作：
抽血姿势一般对生物样本的质量无影响，但是对于血浆蛋白结合率高的药物，由于坐位、站位会使身体中的水从静脉血管渗透到血管外，可升高5%～15%的药物浓度；相反，当从站位改成仰卧位时，血浆体积会稍增大，药物浓度被稀释。又如采血中使用的止血带会增加血液中的蛋白和血脂含量，对血浆蛋白结合率高的药物有影响。因而，进行这类药物的临床试验时，血液采集如果使用止血带，应尽可能快地松开。另外，静脉注射或静脉滴注时，血液样本的采集需从对侧手臂中抽取。
（2）抗凝剂的选择：
为防止血液凝结，一般可在采血管中加入合适浓度的抗凝剂。若抗凝剂为液体配制，为不改变血液样本的浓度，最好在适当的温度下蒸发干燥后使用。目前有含不同抗凝剂的多种商品化采血管可供选择，使用时应把握的基本原则为采血管抗凝剂含的盐不应改变待测物质离子的百分比。例如，待测物质为钠盐，则不应该采用含钠盐的抗凝剂。
（3）其他添加剂的加入：
有些待测物除加入抗凝剂外，还需加入某些稳定剂来防止待测物分解，如酶抑制剂、抗氧化剂（维生素C、焦亚硫酸钠、丁羟基甲苯）、抗还原剂等。
另一种常加入的物质为缓冲液（控制血液中的pH）、衍生化试剂（稳定待测物或者便于分析检测）、有机试剂（用来稳定待测物或抑制酶反应或作为缓冲液增加尿液样本中待测物的溶解性）。
如果某项研究中的确需要加入某种添加剂，在方案设计或制定采血SOP时就必须规定添加剂的类型、添加剂的浓度和体积、添加剂的配制单位和执行者、添加到采血管还是分离出血浆或者血清的冻存管、添加时间点、添加稳定剂的样本的保存条件和时间、可以避免上述添加过程中差错的防范措施、操作相关人员的培训等。
3.样本的前处理
Ⅰ期临床试验的生物样本采集后，需要经过一定的前处理再冻存待测。例如，血浆和血清是目前最常见的生物样本检测基质，通常是将采集到的全血进行离心等前处理得到血浆或者血清。处理的方法步骤应该在制定的SOP中进行详细规定，并设计相关的记录表格。
（1）血浆样本的采集处理：
第一步，选择合适的抗凝剂；第二步，为保证每个样本的抗凝剂在全血中的比例接近，应规定好采集的体积并严格执行；第三步，为保证全血和抗凝剂充分混合应轻轻而缓慢地来回颠倒采血管6～8次；第四步，于4～8℃离心机中在1 500～2 500g下离心5～10分钟；第五步，转移上层血浆至干净的冻存管中（如需备份则需规定备份数量和每份样本体积）；第六步，储存样本进特定的冰箱中（通常为-80℃），如中间需要暂存也需提前规定暂存冰箱温度（-20℃）和可暂存的最长时间。
以上前处理的步骤和条件主要取决于待测物的稳定性，故在设计时需要控制全血采集到分离血浆样本冻存进冰箱的时间、规定分离血浆的环境温度及是否需要使用低温离心机、规定血浆样本的冻存温度等。这些条件都应该在制定SOP时详细规定，每步操作均需有记录、有操作人和核对人签名。
（2）血清样本的采集处理：
血清样本与血浆样本的最大区别在于血清样本没有外加抗凝剂，比血浆含更少的纤维蛋白原。血清样本所需全血的采集步骤与血浆样本一致，只是选择不加抗凝剂的采血管而已。如果采血管中加入促凝剂，则在全血采集后仍需上下轻轻颠倒6～8次，使血液与促凝剂充分混匀，然后在室温（18～24℃）中静置30～60分钟，之后离心、转移血清、冻存的处理步骤与血浆样本一致。
（3）尿液样本的收集处理：
Ⅰ期临床试验的尿液样本主要用于新药排泄途径、代谢产物和物料平衡的研究。尿液样本的前处理貌似比全血、血浆和血清样本简单，且样本量大、易于收集。通常健康的尿液样本包含95%的水分，其余的为电解液（包含Na+、K+、Mg2+、Ca2+和Cl-）、代谢废物（尿素、尿酸、肌酐、小量的激素、氨基酸等），在Ⅰ期临床试验中处理的基本原则是防腐。此外，由于尿液缺少蛋白和油脂类物质凝集待测物，故某些待测物容易吸附在收集容器壁上。
尿液样本的收集与血液样本的采集处理有几点不同。其一，血液样本的采集时间以点为准，时间窗需要准确限定；而尿液样本的收集为时间段，跨越的时间较长。如经典的PK尿液样本的收集为给药前（-2～0小时）、0～2小时、2～4小时、4～6小时、6～8小时、8～12小时、12～24小时和24～48小时。像24～48小时时间段的样本要求收集完全24小时的尿液后再二次定量提取样本冻存，则要求在24小时内待测物在尿液收集的环境中（室温或者4℃）至少是稳定的。其二，因尿液样本的易吸附性，需提前评估尿液样本的收集容器。其三，尿液样本较丰富，分析实验室一般也不会要求保存较大体积的样本，通常是在满足检测灵敏度的前提下收集最小量的混匀尿液样本即可（设计时一般规定大于1次检测量的8倍）。
（4）粪便样本的收集处理：
同理，Ⅰ期临床试验的粪便样本主要用于新药排泄途径、代谢产物和物料平衡的研究。粪便也是分时间段收集，相较于尿液更加烦琐，且需要准确称重。当试验新药具有消化道不良事件的情况下，采样愈加困难。方案设计时重点考量称重的方法、粪便的脱水处理（如冷冻干燥）和存储条件，以及后期测定时的取样原则。
4.记录
记录的目的是保证数据的真实性和完整性，在事件发生后根据适时的记录能完整地追溯事件的发生情况。生物样本的采集、接收、入库、储存、出库、回库记录的目的是保证生物样本具有完整的数据链，万一样本发生问题能追溯到问题发生的根源。按照GCP的原则，记录需及时完整，每步操作均需有相应的记录和记录者签名。记录表格的设计应遵循简单、信息全面、抓住主要信息点但又较易操作的原则。生物样本采集和处理的记录原则应该基于生物样本的方法学验证结果所得的一系列数据来设计，特别是样本的稳定性数据。例如，药物在全血中是否稳定、稳定时间多长，是否需要在采集后马上放置于湿冰中，采集后多长时间内需离心处理等。又如分离出来的血浆样本是否可暂存于某一温度的冰箱中、暂存温度的依据、多长时间内需转移到-70℃或-80℃的冰箱中保存等。应根据实际需要来设计相应的记录表格，实际操作中的每一重要步骤、发生时间和执行人是记录中必不可少的元素。
（三）生物样本检测的一般原则
Ⅰ期临床试验研究中的药动学与生物等效性研究结果的正确与否，在很大程度上与给药后测定的血药浓度数据的准确程度有关，准确可靠的生物样本药物浓度测定方法是Ⅰ期临床试验研究的重要保证条件。
因为Ⅰ期临床试验的创新药具有生理活性强、起始剂量低等特点，生物样本往往具有药物浓度低、药物浓度变化范围大、干扰组分多且不确定、样本不能重复获得等特点，所以生物样本在测定前需要经过一系列的分离、纯化、浓集等前处理过程，同时要求测定方法有良好的选择性、足够的灵敏度、较宽的线性测定范围和准确的精密度。
1.完整的质量控制体系
生物样本检测的准确性主要依赖检测方法的准确性，广义而言，影响检测方法准确性的重要因素是质量体系的完整性能否覆盖人、机、环、法、料五大质量控制环节。人为因素包括人员的素质、能力、诚信和检测实验室的管理水平等；机即设备因素，包含仪器设备的品质、维护保养、是否在校准期限内、仪器的重复性和稳定性等；环境因素为检测相关的仪器设备、试剂耗材是否都在其需要的温湿度范围内运行，待检测药物的稳定性是否有特殊的环境要求，仪器设备对机械振动、电压波动、灰尘、电磁干扰等是否有特殊要求等；法即检测方法是否符合法规和技术指南要求；料即所用的试剂耗材是否在效期内并处于所要求的环境条件中保存等。以上要素在方案设计的质量保证部分必须进行合理的规定。
2.确保分析检测方法学验证的可靠性
影响生物样本检测的准确性的另一重要因素是检测方法的可靠性。可靠的检测方法必须经过严格的方法学验证。方法学验证的具体条款、要求和接受标准在《9012生物样品定量分析方法验证指导原则》第2点“生物分析方法验证”中已有详细描述，本节不再赘述。值得注意的是，即使所建立的分析方法完全按照法规和指南的要求进行逐项的验证，但是一些影响因素不加以注意仍然会影响检测结果的准确性。例如，指导原则中描述方法验证的主要目的是证明特定方法对于测定在某种生物基质中的分析物浓度的可靠性。如果使用与待测样本基质不一致的空白基质配制标准曲线和质控样本，而基质效应的影响又比较明显时，未知样本测定结果的准确性就值得怀疑；当我们难于获得相同的基质，确实需选择适当基质替代时，应充分说明理由，并有相关的试验数据证明2种基质的基质效应不影响检测的结果。另外，对照标准物质对结果准确性的影响非常重要，使用期间内需要保证其储存条件、效期和批号。如若对照品储备液含量不准确或者经长期使用后含量下降，而分析人员用该储备液既配制标准曲线性样本又配制质控样本，用其来定量的未知生物样本的准确性也值得怀疑；又如标准曲线和质控样本使用高比例（＞5%）含有有机溶剂的待测物溶液和空白血样通过添加的方式配制，导致配制的样本和实际样本间的基质含量不一致；还有一些不能通过常规方法学验证发现的问题，如生物样本处理过程的逆转化、源内裂解、质荷比相近的离子的干扰等问题都会导致检测结果的不准确。以上方面在方案设计的方法学验证部分必须根据实验新药的特性进行综合分析，给予符合法规指南的限定。
3.保证方法学验证和未知样本检测方法的一致性
未知样本检测需要遵循《9012生物样品定量分析方法验证指导原则》第3点“试验样品分析”项下对样本的测定、分析批的定义及接受标准、校正曲线的范围及质控样本的接受、样本重分析等的明确要求。此外，我们仍需注意检测样本的方法学验证和未知样本检测方法的一致性也是影响生物样本检测准确性的另一重要因素。方法学使用的空白基质（包括抗凝剂、溶血、脂血等）和未知样本的实际基质是否一致；质控样本的保存方式和实际样本的保存方式是否一致；测定时的分析批的大小是否远远超过方法学验证时的分析批；方法学验证中每分析批使用2条标准曲线，而样本测定使用1条标准曲线等。以上方面在方案设计时也是经常考量的综合因素。
总而言之，生物样本检测应在具备科学完整的质量体系的实验室中完成。研究设计应充分调研待测创新药的背景信息，做好符合法规指南要求的完整的方法学计划（除包含常规的逐项完成的方法学验证项目外，亦应结合待测药物的特性注意控制其他影响准确度的因素）并依从执行，规定方法学验证的判定指标及其报告的要素。检测样本前应根据方法学验证结果制定与之相配套的符合法规指南要求的完整的样本检测计划，规定样本检测结果的判定指标及其报告的要素。与样本检测相关的操作应符合法规的要求，指导原则的技术标准、方案或计划和制定的SOP。样本检测的每一步骤均应有相应的记录佐证溯源。
五、统计分析
本部分阐述生物统计学在Ⅰ期临床试验中使用的应用类型及相应指导原则，阐述统计分析方案的内容及其设计的一般原则，探究对统计学结论与各项Ⅰ期临床试验研究的科学目的和终点评价指标的影响。
（一）概述
一个精心设计的试验方案是临床试验成功的前提，这个方案需要关注所有细节，包括如何执行设计的方案、如何收集试验数据，以及如何对所收集得到的数据进行统计分析，即试验方案必须包含统计学部分。统计分析的基本内容包括设计的类型、比较的类型、随机化与盲法、主要和次要反应指标的定义与测量、样本量大小的估计、检验假设、数据集的定义、有效性和安全性评价指标及统计分析的详细计划。确证性试验要求提供主要指标的所有主要特征及预期分析方法。探索性试验通常描述概括性的原则和方法。
探索性临床试验也应有清晰和明确的目标。探索性试验有时需要更灵活可变的方法进行设计并对数据进行分析，以便根据逐渐积累的结果对后期的确证性试验设计提供相应的信息。虽然探索性试验对有效性的确证有参考价值，但不能作为证明有效性的正式依据。
确证性临床试验是为证明药物对预期适应证和受试人群的有效性和安全性提供有力证据。研究内容涉及剂量-效应关系的进一步确认，或对更广泛人群、疾病的不同阶段，或合并用药等情况的研究等。进入确证性临床试验意味着在探索性临床试验的基础上对目标适应证的有效性进行确证。确证性临床试验大多应该包含阳性药物对照，以比较新药与目前标准治疗的有效性和安全性。确证性试验是一种事先提出假设并对其进行检验的随机对照试验，以说明所开发的药物对临床是有益的。因此，对涉及药物有效性和安全性的每个关键问题都需要通过确证性试验予以充分的回答。
（二）统计分析方案的内容
1.试验概述
描述试验方案中与数据管理相关的内容，一般包括研究目的和总体设计，如随机化方法及其实施、盲法及设盲措施、受试者数量、评估指标、试验的关键时间节点、重要的数据分析安排及对应的数据要求等。
试验概述是试验方案中与统计学相关的部分，常可直接摘录。一般包括以下主要内容：
（1）研究目的：
临床试验的主要目的和次要目的。
（2）设计类型：
如平行设计、交叉设计、析因设计、成组序贯设计等。
（3）对照的类型：
如安慰剂对照、阳性对照、剂量组对照等，需说明试验选择的对照类型及理由。
（4）随机化方法及其实施：
明确随机化方法，如区组随机、分层随机及其分层因素等。
（5）盲法及设盲措施：
说明是单盲还是双盲。设盲措施是双盲单模拟、双盲双模拟等，以及保持盲态下执行统计分析的措施。若采用开放设计，需充分说明无法实施盲法的理由。
（6）样本量：
计划入组的受试者数量及其计算依据。若采用成组序贯设计，应说明不同阶段的样本量。
2.统计分析流程
（1）统计分析计划：
根据《药物临床试验数据管理与统计分析的计划和报告指导原则》，要保证临床试验数据的质量和科学评价药物的有效性与安全性，必须事先对数据管理工作和统计学分析原则制定详细的计划书。通过机制流程和SOP剥夺统计人员数据造假的机会，也预防犯错。统计分析报告（statistical analysis report，SAR）是根据统计分析计划（statistical analysis plan，SAP），对试验数据进行统计分析后形成的报告，是临床试验结果的重要呈现手段，是撰写临床研究报告（clinical study report，CSR）的重要依据，并与统计分析计划一起作为药物注册上市的申报资料提交给监管部门用于对临床试验结果的评价。
（2）分析集的定义和创建：
用于统计的分析集需在试验方案的统计部分中明确定义，并在盲态审核时确认每位受试者所属的分析集。在定义分析集时，需遵循以下2个原则：①使偏倚达到最小；②控制Ⅰ类错误的增加。
根据意向性分析（ITT）的基本原则，主要分析应包括所有随机化的受试者。即需要完整地随访所有随机化对象的研究结果，但在实际操作中往往难以达到。因此，常采用全分析集进行分析。
全分析集（FAS）是指尽可能接近符合意向性治疗原则的理想的受试者集，该数据集是从所有随机化的受试者中以最少的和合理的方法剔除受试者后得出的。在选择全分析集进行统计分析时，对主要指标缺失值的估计可以采用最接近的一次观察值进行结转（last observation carry forward，LOCF）。
受试者的“符合方案集”（PP）亦称为“可评价病例”样本，它是全分析集的一个子集，这些受试者对方案更具依从性。依从性包括以下一些考虑，如接受治疗、主要指标可以测定以及没有对试验方案的大的违反等。将受试者排除在符合方案集之外的理由应在盲态审核时阐明，并在揭盲之前用文件写明。
（3）图表程序：
统计分析结果通常以统计分析表或图的形式呈现，计划中应该以简明的格式、精练的文字描述所有相关信息。
（4）质量控制（QC）：
数据管理计划需确定数据及数据管理操作过程的质控项目、质控方式（如质控频率、样本选取方式及样本量等）、质量要求及达标标准、对未达到预期质量标准的补救措施等。
统计分析计划（SAP）的QC可以从以下方面执行，但并不限于此：
1）检查标题、页脚、标题、内容、正文的格式和字体是否与CTD格式一致。
2）检查所有缩写是否在首次使用时就定义。
3）检查研究概述、研究目标、研究终点的描述是否与协议中的描述一致。
4）检查分析集、基线和数据分析方法的定义是否正确。
5）检查统计模型和相关假设、描述是否正确。
6）检查TFL模板是否足够并与SAP中的描述一致。
7）检查治疗、研究时间等在整个TFL模板中是否以相同的方式提及。检查《药物临床试验数据管理与统计分析的计划和报告指导原则》要求的所有信息是否包括在SAP和附录中。
（5）统计分析报告：
统计分析报告的基本内容包括试验概述、统计分析方法、统计分析的结果与结论，一般采用统计表和统计图表示。统计分析报告中的所有结论应使用准确的统计学术语阐述。
（6）存档：
生物统计学家或项目负责人负责提供SAP/SAR草案，以在最终确定之前与临床药理学主任（CPD）和申办者讨论，生物统计学家应根据收集的意见准备最终的SAP/SAR。SAP/SAR的最终版本将由申办者提交给CPD，以获得批准、签名和官方印章。草案版本从版本0.1开始，以下版本应为版本0.2、0.3等，具有SAP/SAR和申办者批准的最终版本应为1.0版本。通常，对于每项研究将提供2～3个版本。生物统计学家应该准备一个基本的文件跟踪器。最后项目负责人将负责SAP的存档。
（三）统计学结论
1.描述性统计分析
一般多用于人口学资料、基线资料和安全性资料，包括对主要指标和次要指标的统计描述。人口学资料和基线特征分析主要包括病史、家族史、药物过敏史以及疗效指标的基线值。
2.参数估计、置信区间和假设检验
参数估计、置信区间和假设检验是对主要指标及次要指标进行评价和估计的必不可少的手段。在试验方案中应当说明要检验的假设和待估计的处理效应、统计分析方法以及所涉及的统计模型。处理效应的估计应同时给出置信区间，并说明计算方法。假设检验应明确说明所采用的是单侧还是双侧检验，如果采用单侧检验，应说明理由。
3.协变量分析
近年来，评价药物有效性的主要指标除药物作用外，常常还有其他因素的影响，如受试者的基线情况、不同治疗中心受试者之间的差异等，这些因素在统计学中可作为协变量处理，即采用协变量分析方法。在试验前应认真识别可能对主要指标有重要影响的协变量及如何进行分析以提高估计的精度，补偿处理组间由于协变量不均衡所产生的影响。
根据主要指标的统计分析结果，结合研究的设计类型、样本量、试验实施情况、次要指标及敏感性分析结果等阐述证据的充分性和结果的稳健性，并给出统计学结论：明确针对主要指标的统计假设是否成立，并简要描述安全性的主要统计结果。
（梁茂植 余勤 杨劲 冯仕银）
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