四、生物活性玻璃诱导牙髓组织再生的研究
人类牙齿常常受到龋病和外伤的侵袭，引发牙本质的缺损以及牙髓组织的损伤坏死，一旦发生很难恢复，直接影响牙齿的健康和功能。目前临床上对牙体牙髓疾病的治疗方法仍然以物理性替代充填治疗为主，如根管治疗、树脂充填，这些治疗方法虽然能在一定程度上延长牙齿的使用寿命，但无法保证牙齿的正常生理结构与功能。由于牙髓的丧失加上治疗过程带来的创伤，经过根管治疗的牙齿长期保存率大大低于正常牙齿。此外，年轻恒牙牙髓活性过早丧失还将终止牙根进一步的发育成熟。理想的疾病治疗方法是促使创伤愈合，最大程度上恢复组织器官原有的生理结构和功能。因此，在牙体牙髓病的治疗过程中，如果能够诱导丧失的牙髓及牙本质的再生，将是一项有意义的工作，一直是牙髓病学研究的重要领域和发展方向。
牙髓中含有成牙本质细胞，主要功能是产生牙本质，该细胞形成突起伸入到周围致密的牙本质中，构成牙髓牙本质复合体结构。牙髓牙本质复合体是牙齿的主体以及功能结构，也是牙本质区别于骨组织的结构特征，赋予牙齿独特的感知及防御能力，能够对外界刺激作出反应，在一些情况下能够重新启动分化程序新生牙本质，从而在一定程度上保护牙髓组织。因此，牙髓牙本质复合体的形成是实现牙髓再生的重要标志。理想的牙髓再生甚至全牙再生的最终目的之一是牙髓牙本质复合体组织结构的再生，即成牙本质细胞呈高柱状沿牙本质的矿化前沿极性排列，同时成牙本质细胞的细胞质形成成牙本质细胞凸起嵌入钙化成牙本质基质，牙本质基质含有相应的牙本质小管结构，恢复牙髓牙本质复合体的感觉、营养、形成和保护功能。
牙髓再生可以分为原位组织再生和组织工程再生两种。原位组织再生是使用生长因子或生物活性材料植入患处，诱导机体自身组织再生修复牙髓。组织工程再生是指使用前体细胞或干细胞体外培养扩增后，接种于合适的可吸收支架材料上，经过体外培养后植入患处，随着支架材料的降解，宿主血管和神经的长入，实现牙髓再生。不管是原位组织再生，还是组织工程再生，都离不开合适的生物活性材料的使用。目前用于牙髓牙本质再生的材料主要有天然高分子材料（如胶原、明胶、藻酸盐、壳聚糖、纤维素、丝蛋白等），人工合成高分子聚合材料[如聚乳酸（polylactic acid，PLA）、聚乙交酯（poly glycolic acid，PGA）、聚丙交酯乙交酯（polylactide-co-glycolide，PLGA）、聚己内酯（polyepsiloncaprolactone，PCL等）]和无机材料[如羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）、磷酸三钙（tricalcium phosphate，TCP）、生物活性玻璃（bioactive glass，BG）]等。天然和人工合成的高分子生物材料只能为牙髓再生提供支持作用，不具备诱导再生的牙髓组织分化形成功能性牙本质的生物诱导能力，且在免疫源性和降解性等方面存在不足。一些生物陶瓷材料兼具生物活性和生物可降解性，对探索适于牙髓牙本质复合体再生的第三代生物材料具有重要意义。
（一）生物活性玻璃对人牙髓细胞的生物学作用
生物活性玻璃的研究和开发，在很大程度上弥补了传统生物材料的缺陷，成为第三代生物材料的典型代表，带动和促进了骨组织工程和原位骨组织再生的发展。生物活性玻璃良好的生物诱导活性及在骨科的成功应用提示其也可能用于牙髓及牙本质的修复再生治疗。研究表明，生物活性玻璃对牙髓细胞具有良好的生物相容性，将二者通过Transwell小室共培养，细胞增殖活性与空白对照组相比无统计学差异。近些年，生物活性玻璃的制备方法和工艺得到了很大的发展，与传统的熔融法制备的生物活性玻璃相比，新一代溶胶-凝胶法制备的生物活性玻璃所含孔隙增多，比表面积和硅含量增加，生物活性提高。此外，材料尺寸结构和元素组成的不同，也决定了材料在表征和性能上的差别。在生物活性玻璃里添加锶的成分能促进牙髓细胞的成牙本质向分化，低浓度的锶（0.1～2.5mmol/L）能够促进牙髓细胞的增殖和ALP活性，但对克隆形成率和细胞迁移没有影响。特定浓度的锶能够通过钙敏受体（calcium sensing receptor，CaSR）及下游MAPK信号通路促进成牙相关基因DSPP、DMP的表达，以及胶原的分泌和基质的矿化。通过将纳米生物活性玻璃表面氨基化，能够将其从负电荷变成正电荷，有利于吸附生物大分子或药物。此外，研究发现氨基化的纳米生物活性玻璃颗粒被牙髓细胞内吞后显著提高胞内钙磷离子浓度，促进成牙本质分化相关指标DMP-1、DSPP和OCN的表达。
北京大学口腔医学院董艳梅教授课题组利用我国材料学家们制备的新型微纳米生物活性玻璃在牙髓再生领域开展了系列的研究。该课题组的研究发现：将牙髓细胞接种于附着有生物活性玻璃颗粒的培养板上，原本均匀分布的牙髓细胞逐渐以生物活性玻璃簇为中心围绕材料生长。通过扫描电镜可见牙髓细胞在生物活性玻璃颗粒表面完全铺展，覆盖材料表面，还可观察到细胞伪足伸展到纳米材料簇结构之中。将生物活性玻璃加入Transwell下室中，其释放的离子可诱导上室中更多的牙髓细胞迁移，表明生物活性玻璃对人牙髓细胞具有趋化作用。生物活性玻璃还能够增强牙髓细胞中黏附相关因子的表达，促进牙髓细胞增殖和矿化结节形成，成牙本质向分化标志物DMP-1、DSPP表达增强。研究还比较了具有相同组成成分，但尺寸结构上存在差异的微米及纳米生物活性玻璃对牙髓细胞的生物学作用，发现纳米生物活性玻璃较微米生物活性玻璃具有更高的生物活性，对牙髓的成牙诱导活性更强，在牙髓牙本质再生方面具有更好的应用前景。生物活性玻璃的纳米尺寸结构特征赋予了其更高的比表面积和总孔体积，从而使得纳米生物活性玻璃在体内接触体液的面积更大，离子释放速度增快，加速了生物活性材料与牙髓细胞作用的整个反应进程。另外，生物活性玻璃的纳米表面形貌提高了材料的表面粗糙度，丰富了材料的表面空间构象，为牙髓细胞提供了更多的活性位点和生物信号，有利于蛋白和细胞的黏附和相互作用，使牙髓细胞能够在纳米生物活性玻璃表面快速而紧密地贴附。随着体液中纳米生物活性玻璃材料释放离子，牙髓细胞快速作出反应，朝向材料的方向迁移，溶液中的离子浓度也可直接影响牙髓细胞成牙分化相关基因的表达。另外，采用植酸为前驱体合成的生物活性玻璃（phytic acid derived bioactive CaO-P2O5-SiO2gel-glasses，PSC）是用溶胶-凝胶法制备而得，植酸（C6H18O24P6）作为磷的前驱体，是从植物种子中提取的一种有机磷酸类化合物，与传统磷前驱体相比毒性小，显著提高了PSC的生物相容性。同时PSC是在低温、低毒及低成本下制备，在原子水平具有均匀的结构，可在更大组分范围实现其生物活性。本课题组研究PSC对牙髓细胞的作用发现，PSC浸提液相较于传统45S5浸提液促进牙髓细胞增殖作用更显著，能够更早和更强地促进牙髓细胞表达DSPP和DMP-1以及矿化结节的形成，PSC分泌离子的速率和浓度、表面羟基磷灰石的形成速度是影响牙髓细胞成牙本质方向分化基因表达的重要因素。
通过上述文献回顾和研究发现，生物活性玻璃能够促进牙髓细胞的增殖、迁移、成牙本质向分化和矿化，这是其可在牙髓牙本质再生领域应用的基础。
（二）生物活性玻璃在牙髓再生中的研究与应用
基于生物活性玻璃对牙髓细胞的增殖和成牙本质方向分化具有良好的诱导性，研究者希望通过将其与其他高分子材料复合以提高支架在牙髓再生中的诱导能力。Won-Jung Bae等证实含有纳米生物活性玻璃的胶原复合支架的成牙诱导能力强于单纯的胶原支架。Ga-Hyun Kim等也证实生物活性玻璃-聚己内酯-明胶支架材料能够通过激活整合素、BMP及MAPK信号通路，从而促进牙髓细胞的成牙向分化。Qu等证实含生物活性玻璃的纳米纤维明胶支架材料能够有效促进牙髓细胞的增殖和成牙向分化。Hyun-Chang Lim等将装载有地塞米松的纳米生物活性玻璃颗粒与聚己内酯/明胶复合，利用电纺丝技术制备支架材料，实现药物缓释，能够显著增强牙髓细胞的增殖、成牙本质向分化及矿化能力；对信号通路的研究发现，整合素、BMP及mTOR介导的信号通路激活在该复合支架成牙诱导中发挥作用。本课题组的研究也证实牙髓细胞在聚己内酯/亚微米生物活性玻璃复合支架上的增殖及成牙本质向分化能力更强。
牙髓牙本质复合体的形成是牙髓再生的重要标志。董艳梅课题组率先使用多种动物模型探索了生物活性玻璃在体内诱导牙髓牙本质复合体再生的作用。首先采用经典裸鼠皮下异位移植实验，将微纳米生物活性玻璃与大鼠磨牙牙冠复合后行裸鼠皮下异位埋植，成功证明了生物活性玻璃对牙髓牙本质功能复合体再生的诱导作用。研究者取SD大鼠磨牙自牙颈部断开，弃去牙根，保留冠部硬组织及冠髓组织，将消毒后的生物活性玻璃铺放于牙冠冠髓断面上，而后植入裸鼠皮下。对照组即单独的牙冠经皮下埋植后，2周时牙髓内部即可见少量散在不规则团块状基质的生成，新生基质前沿的细胞呈扁平状，少量散在的细胞胞体被包裹在新生的基质中，结构形态类似于新生骨组织（图9-19A、图9-19B），6周时牙髓内部新生的不规则基质团块增多，冠部原发性牙本质下方亦可见少量新生的基质（图9-19C、图9-19D）。纳米生物活性玻璃组2周时在植入牙冠的牙髓断面上可见被均匀染色的新生基质，基质在近髓侧连成一层，表面整齐排列有高柱状的呈极向分布的类成牙本质样细胞，牙冠内部的牙髓组织形态正常（图9-19E、图9-19F）；6周时，纳米生物活性玻璃材料上方近髓侧生成更多形态规则、厚度一致的细胞外基质，基质的前沿部分可见类似前期牙本质样结构，并可见牙本质小管样结构贯穿新生的牙本质样组织当中，新生成的矿化基质与其表面高柱状类成牙本质细胞共同形成牙髓牙本质复合体样结构。冠部原发性牙本质下方也可见新生成的类牙本质层，并与材料上方的类牙本质层连接成一个整体，牙冠内部牙髓组织正常，可见大量的血管（图9-19G、图9-19H）；6周时，微米生物活性玻璃组材料上方也能看见牙髓牙本质复合体样结构的生成，但新生牙本质层较纳米生物活性玻璃组薄（图9-19I、图9-19J）。
采用类似的裸鼠皮下异位移植研究发现与45S5组相比，以植酸为前驱体制备的生物活性玻璃PSC能够诱导形成更规整的、具有牙本质小管的牙髓牙本质复合体组织，且形成的牙本质层更厚（图9-20）。
基于体内外的系列研究，我们提出生物活性玻璃诱导牙髓牙本质复合体形成的机制可能是：生物活性玻璃可诱导牙髓中或根尖来源的一些干细胞或者前体细胞由成纤维状分化形成高柱状的类成牙本质细胞，在生物活性玻璃表面极性整齐排列。随着细胞的极性分布，会在生物活性玻璃的表面分泌基质并矿化。在基质的分泌过程中，生物活性玻璃表面形成的类成牙本质细胞向着一个方向移动，在移动的过程中留有成牙本质细胞突起包埋在新生的基质中，生成的矿化组织与天然的牙髓牙本质复合体结构类似（图9-21）。
图9-19 微纳米生物活性玻璃诱导牙髓牙本质复合体形成的体内研究
A和B.牙冠经皮下埋植2周后的Masson染色结果，B图为A图的局部放大；C和D.牙冠经皮下埋植6周后的Masson染色结果，D图为C图的局部放大；E和F.牙冠与n-BG复合后经皮下埋植2周的Masson染色结果，F图为E图的局部放大；G和H.牙冠与n-BG复合后经皮下埋植6周的Masson染色结果，H图为G图的局部放大；I和J.牙冠与m-BG复合后经皮下埋植6周的Masson染色结果，J图为I图的局部放大；D：dentin，牙本质；DL.dentin-like tissues，牙本质样组织；m-BG.micro-bioactive glass，微米生物活性玻璃；n-BG.nano-bioactive glass，纳米生物活性玻璃；OB.odontoblast-like cells，成牙本质样细胞；OL.osteodentin-like tissues，骨样牙本质组织；P.pulp tissue，牙髓组织；W.周。
图9-20 PSC诱导牙髓牙本质复合体形成的体内研究
A和B.牙冠经皮下埋植2周和6周后的Masson染色结果；C和D.牙冠与PSC复合后经皮下埋植2周和6周后的Masson染色结果；E和F.牙冠与45S5复合后经皮下埋植2周和6周后的Masson染色结果；BG.bioactive glass，生物活性玻璃，见黑色箭头；DL.dentin-like tissues，牙本质样组织，见红色箭头；ODL.odontoblast-like cells，成牙本质样细胞，见绿色箭头；P.pulp tissue，牙髓组织；W.周。
图9-21 生物活性玻璃诱导牙髓牙本质复合体形成机制的模式图
已有研究表明了生物活性玻璃在牙髓损伤修复再生方面具有良好的应用潜质。但生物活性玻璃的成牙诱导活性受其组成、结构、形貌等因素影响，还需进一步研究明确何种类型和结构的生物活性玻璃最有利于牙髓损伤的修复再生治疗。
（董艳梅 王赛楠 崔彩云 盛旭燕 龙赟子）